| 致谢 | 第4-9页 |
| 摘要 | 第9-10页 |
| 第一章 文献综述 | 第10-17页 |
| 1.1 黑曲霉概述 | 第10页 |
| 1.2 发酵过程中黑曲霉形态对产量的影响 | 第10页 |
| 1.3 改变丝状真菌形态的几种方法 | 第10-11页 |
| 1.3.1 通过改变发酵培养基中营养成分和离子浓度来控制菌丝的形态 | 第10-11页 |
| 1.3.2 通过控制发酵过程中物理化学条件来控制菌丝的形态 | 第11页 |
| 1.3.3 利用微粒子来控制菌丝的形态 | 第11页 |
| 1.3.4 通过基因工程的方法对菌丝的形态进行改造 | 第11页 |
| 1.4 基因敲除策略 | 第11-13页 |
| 1.4.1 同源重组 | 第11-12页 |
| 1.4.2 反义RNA | 第12页 |
| 1.4.3 RNAi | 第12-13页 |
| 1.5 基因转化方法 | 第13-16页 |
| 1.5.1 电击转化法 | 第13-14页 |
| 1.5.2 基因枪法 | 第14页 |
| 1.5.3 聚乙二醇介导的原生质体转化法 | 第14页 |
| 1.5.4 农杆菌转化法 | 第14-15页 |
| 1.5.5 脂质体转化方法 | 第15-16页 |
| 1.6 打靶载体的构建方法 | 第16页 |
| 1.6.1 传统打靶载体构建方法 | 第16页 |
| 1.6.2 重叠PCR构建打靶载体 | 第16页 |
| 1.7 黑曲霉中的选择标记基因 | 第16-17页 |
| 第二章 引言 | 第17-18页 |
| 第三章 brsa-25基因同源片段的构建 | 第18-38页 |
| 3.1 实验材料 | 第18页 |
| 3.1.1 菌株与载体 | 第18页 |
| 3.1.2 培养基和药品试剂 | 第18页 |
| 3.1.3 实验仪器 | 第18页 |
| 3.2 实验方法 | 第18-26页 |
| 3.2.1 黑曲霉A09的培养 | 第18-19页 |
| 3.2.2 黑曲霉A09基因组总DNA的提取 | 第19页 |
| 3.2.3 根据brsa-25基因翻译出的蛋白序列找到基因序列 | 第19-21页 |
| 3.2.4 扩增brsa-25基因 | 第21页 |
| 3.2.5 设计构建同源重组片段的特异引物 | 第21-22页 |
| 3.2.6 同源重组片段各段序列的扩增 | 第22-24页 |
| 3.2.7 同源重组片段的连接 | 第24-25页 |
| 3.2.8 对同源重组片段进行割胶回收 | 第25-26页 |
| 3.3 结果与分析 | 第26-37页 |
| 3.3.1 黑曲霉A09基因组DNA的提取 | 第26-27页 |
| 3.3.2 黑曲霉A09 brsa-25基因的扩增结果和测序结果 | 第27-29页 |
| 3.3.3 构建同源重组片段需要的三个基因片段的扩增结果 | 第29页 |
| 3.3.4 同源重组片段融合结果和重组片段测序结果 | 第29-37页 |
| 3.4 本章小结 | 第37-38页 |
| 第四章 同源重组片段与T载体的连接 | 第38-45页 |
| 4.1 实验材料 | 第38页 |
| 4.1.1 菌种和载体 | 第38页 |
| 4.1.2 培养基与试剂 | 第38页 |
| 4.1.3 仪器设备 | 第38页 |
| 4.2 实验方法 | 第38-42页 |
| 4.2.1 传统的T-A连接方法 | 第38-40页 |
| 4.2.2 同源重组连接方法 | 第40-42页 |
| 4.3 实验结果 | 第42-44页 |
| 4.3.1 传统的T-A连接结果 | 第42-43页 |
| 4.3.2 同源重组连接结果 | 第43-44页 |
| 4.4 本章小结 | 第44-45页 |
| 第五章 脂质体转化 | 第45-54页 |
| 5.1 实验材料 | 第45-46页 |
| 5.1.1 菌株和试剂 | 第45页 |
| 5.1.2 培养基 | 第45页 |
| 5.1.3 实验仪器 | 第45-46页 |
| 5.2 实验方法 | 第46-50页 |
| 5.2.1 brsa-25同源重组片段的扩增和回收 | 第46-47页 |
| 5.2.2 黑曲霉的培养 | 第47页 |
| 5.2.3 黑曲霉对潮霉素的抗性 | 第47页 |
| 5.2.4 脂质体转化 | 第47-50页 |
| 5.3 实验结果 | 第50-53页 |
| 5.3.1 通过引物P7、P8扩增出来的片段结果和片段回收结果 | 第50-51页 |
| 5.3.2 黑曲霉孢子对潮霉素的抗性检测结果 | 第51-52页 |
| 5.3.3 脂质体转化结果 | 第52-53页 |
| 5.4 本章小结 | 第53-54页 |
| 第六章 电击转化黑曲霉孢子 | 第54-60页 |
| 6.1 实验材料和仪器 | 第54-55页 |
| 6.1.1 实验材料 | 第54页 |
| 6.1.2 培养基 | 第54页 |
| 6.1.3 实验仪器 | 第54-55页 |
| 6.2 实验方法 | 第55-57页 |
| 6.1.1 培养黑曲霉 | 第55页 |
| 6.1.2 收集黑曲霉孢子 | 第55页 |
| 6.1.3 黑曲霉孢子电击转化 | 第55页 |
| 6.1.4 提取拟转化子基因组DNA和正常黑曲霉基因组DNA | 第55页 |
| 6.1.5 对拟转化子进行PCR验证 | 第55-57页 |
| 6.3 实验结果 | 第57-59页 |
| 6.3.1 实验组和对照组黑曲霉孢子潮霉素终浓度100μg/mL的平板上萌发情况 | 第57页 |
| 6.3.2 黑曲霉拟转化子和正常菌株基因组的提取情况 | 第57-58页 |
| 6.3.3 潮霉素抗性基因扩增条带 | 第58-59页 |
| 6.3.4 左端跨区域扩增条带 | 第59页 |
| 6.3.5 右端跨基因扩增条带 | 第59页 |
| 6.4 本章小结 | 第59-60页 |
| 第七章 结论与讨论 | 第60-61页 |
| 7.1 同源重组片段的构建 | 第60页 |
| 7.2 同源重组片段与T载体连接 | 第60页 |
| 7.3 黑曲霉brsa-25基因缺失菌株的构建 | 第60-61页 |
| 参考文献 | 第61-64页 |
| ABSTRACT | 第64页 |
