| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 主要符号表 | 第15-16页 |
| 第1章 绪论 | 第16-28页 |
| 1.1 定点诱变技术的简介 | 第16页 |
| 1.2 定点诱变的意义 | 第16-17页 |
| 1.2.1 定点诱变在基础研究中的意义 | 第16-17页 |
| 1.2.2 定点诱变在实际应用中的意义 | 第17页 |
| 1.3 定点诱变的方法 | 第17-24页 |
| 1.3.1 Kunkel法 | 第17-18页 |
| 1.3.2 盒式诱变法 | 第18-19页 |
| 1.3.3 PCR介导的定点诱变法 | 第19-22页 |
| 1.3.3.1 重叠延伸PCR定点诱变法 | 第19-20页 |
| 1.3.3.2 大引物PCR定点诱变法 | 第20-21页 |
| 1.3.3.3 Quikchange定点诱变法 | 第21-22页 |
| 1.3.4 定点饱和诱变法 | 第22-23页 |
| 1.3.5 目前主流的定点突变试剂盒 | 第23-24页 |
| 1.3.5.1 Q5(?)定点突变试剂盒 | 第23页 |
| 1.3.5.2 MutanBEST试剂盒 | 第23-24页 |
| 1.4 CRISPR-Cas9技术 | 第24-26页 |
| 1.4.1 CRISPR-Cas9技术的简介 | 第24-25页 |
| 1.4.2 CRISPR-Cas9技术的应用 | 第25-26页 |
| 1.5 本研究的目的及意义 | 第26-28页 |
| 第2章 材料与方法 | 第28-38页 |
| 2.1 村料 | 第28-32页 |
| 2.1.1 实验试剂 | 第28页 |
| 2.1.2 实验仪器 | 第28-29页 |
| 2.1.3 实验所用质粒和菌株 | 第29页 |
| 2.1.4 培养基的配置 | 第29页 |
| 2.1.5 实验所用的主要溶液 | 第29-30页 |
| 2.1.6 实验所需主要引物 | 第30-32页 |
| 2.2 方法 | 第32-38页 |
| 2.2.1 常规基因操作方法 | 第32-33页 |
| 2.2.2 Cas9表达质粒的构建 | 第33-34页 |
| 2.2.3 Cas9蛋白的表达 | 第34页 |
| 2.2.4 Cas9蛋白的纯化 | 第34-35页 |
| 2.2.5 Cas9蛋白的浓度测定 | 第35页 |
| 2.2.6 sgRNA的体外转录 | 第35-36页 |
| 2.2.7 Cas9蛋白介导的体外酶切 | 第36页 |
| 2.2.8 T5外切酶介导的体外重组 | 第36-37页 |
| 2.2.9 T4 DNA聚合酶介导的末端平滑化 | 第37-38页 |
| 第3章 结论 | 第38-60页 |
| 3.1 Cas9蛋白表达质粒的构建 | 第38-39页 |
| 3.1.1 Cas9基因的合成 | 第38页 |
| 3.1.2 PET23a-Cas9表达质粒的构建 | 第38-39页 |
| 3.2 Cas9蛋白的表达和纯化 | 第39页 |
| 3.3 Cas9蛋白酶切活性验证预实验 | 第39-40页 |
| 3.4 ICM系统介导的单点诱变 | 第40-48页 |
| 3.4.1 ICM系统的原理 | 第40-41页 |
| 3.4.2 ICM系统介导的GFP基因的突变 | 第41-45页 |
| 3.4.3 ICM系统的实验条件优化 | 第45-46页 |
| 3.4.3.1 T5核酸外切酶的使用 | 第45页 |
| 3.4.3.2 实验酶切条件的优化 | 第45-46页 |
| 3.4.4 ICM系统介导的一步构建多个单点突变体 | 第46-48页 |
| 3.5 ICM系统介导的双点诱变 | 第48-49页 |
| 3.6 ICM系统介导的大质粒诱变 | 第49-50页 |
| 3.7 ICM系统介导的定点饱和诱变 | 第50-57页 |
| 3.7.1 NNK密码子随机引物介导的单点定点饱和诱变 | 第50-52页 |
| 3.7.2 NNN密码子随机引物介导的双点定点饱和诱变 | 第52-55页 |
| 3.7.3 三联体密码子介导的定点饱和突变 | 第55-57页 |
| 3.8 ICM系统介导的定点诱变的应用 | 第57-60页 |
| 第4章 讨论与展望 | 第60-63页 |
| 4.1 讨论 | 第60-62页 |
| 4.2 展望 | 第62-63页 |
| 参考文献 | 第63-67页 |
| 附录 | 第67-68页 |
| 致谢 | 第68页 |
