| 摘要 | 第8-9页 |
| ABSTRACT | 第9-10页 |
| 中英文缩略词表(Abbreviation) | 第11-12页 |
| 1 文献综述 | 第12-24页 |
| 1.1 Kisspeptin研究进展 | 第12-18页 |
| 1.1.1 Kisspeptin和GPR54的发现 | 第12-14页 |
| 1.1.2 Kisspeptin和GPR54的分布 | 第14页 |
| 1.1.3 Kisspeptin/GPR54系统的功能 | 第14-18页 |
| 1.1.3.1 启动动物初情期的作用 | 第14-15页 |
| 1.1.3.2 对动物季节性繁殖的调控 | 第15-16页 |
| 1.1.3.3 对母羊生殖内分泌的调控作用 | 第16-18页 |
| 1.2 毕赤酵母表达系统 | 第18-23页 |
| 1.2.1 毕赤酵母表达系统的特点 | 第18-19页 |
| 1.2.2 毕赤酵母表达系统的组成 | 第19-20页 |
| 1.2.2.1 表达宿主 | 第19-20页 |
| 1.2.2.2 表达载体 | 第20页 |
| 1.2.3 毕赤酵母表达的影响因素 | 第20-23页 |
| 1.2.3.1 外源基因的影响 | 第20-21页 |
| 1.2.3.2 培养条件的影响 | 第21-23页 |
| 1.3 本研究的目的与意义 | 第23-24页 |
| 2 材料和方法 | 第24-41页 |
| 2.1 试验材料 | 第24-28页 |
| 2.1.1 主要材料 | 第24页 |
| 2.1.2 主要试剂与药品 | 第24-25页 |
| 2.1.3 主要仪器设备 | 第25-26页 |
| 2.1.4 主要试剂的配制 | 第26-28页 |
| 2.2 试验方法 | 第28-41页 |
| 2.2.1 基因与载体准备 | 第28-31页 |
| 2.2.1.1 基因优化与合成 | 第28-29页 |
| 2.2.1.2 pPICZαA质粒保种菌培养及质粒提取 | 第29-30页 |
| 2.2.1.3 目的基因与载体的酶切鉴定 | 第30页 |
| 2.2.1.4 酶切产物的回收 | 第30-31页 |
| 2.2.2 pPICZαA-Kp53重组载体的构建 | 第31-33页 |
| 2.2.2.1 目的基因与载体连接 | 第31页 |
| 2.2.2.2 连接产物转化到大肠杆菌Trans5a感受态细胞 | 第31页 |
| 2.2.2.3 挑取单菌落扩大培养 | 第31-32页 |
| 2.2.2.4 菌液PCR鉴定 | 第32页 |
| 2.2.2.5 阳性菌液质粒小提 | 第32-33页 |
| 2.2.2.6 酶切鉴定 | 第33页 |
| 2.2.3 重组表达载体的转化 | 第33-36页 |
| 2.2.3.1 毕赤酵母GS115感受态细胞制备 | 第33-34页 |
| 2.2.3.2 重组载体线性化 | 第34页 |
| 2.2.3.3 线性化产物提取 | 第34-35页 |
| 2.2.3.4 线性化产物电转 | 第35页 |
| 2.2.3.5 阳性转化子鉴定 | 第35-36页 |
| 2.2.4 毕赤酵母阳性转化子的诱导表达 | 第36页 |
| 2.2.5 BCA法检测发酵上清蛋白浓度 | 第36-37页 |
| 2.2.6 Tricine-SDS-PAGE鉴定 | 第37-38页 |
| 2.2.6.1 样品准备 | 第37页 |
| 2.2.6.2 Tricine-SDS-PAGE胶制备及电泳 | 第37-38页 |
| 2.2.6.3 条带显色 | 第38页 |
| 2.2.7 WesternBlot检测 | 第38-39页 |
| 2.2.7.1 转膜 | 第38页 |
| 2.2.7.2 清洗与封闭 | 第38-39页 |
| 2.2.7.3 抗体孵育 | 第39页 |
| 2.2.7.4 ECL化学发光 | 第39页 |
| 2.2.8 诱导表达条件的优化 | 第39-40页 |
| 2.2.8.1 诱导时间 | 第39-40页 |
| 2.2.8.2 诱导温度 | 第40页 |
| 2.2.8.3 甲醇浓度 | 第40页 |
| 2.2.9 诱导产物的纯化 | 第40-41页 |
| 2.2.10 纯化产物Kp53的生物活性研究 | 第41页 |
| 3 结果与分析 | 第41-52页 |
| 3.1 表达载体与目的基因的鉴定 | 第41-42页 |
| 3.1.1 pPICZαA载体的双酶切鉴定 | 第41-42页 |
| 3.1.2 目的基因的双酶切鉴定 | 第42页 |
| 3.2 重组表达质粒的构建 | 第42-44页 |
| 3.2.1 重组表达质粒的酶切鉴定 | 第42-43页 |
| 3.2.2 重组表达质粒的PCR鉴定 | 第43-44页 |
| 3.2.3 测序鉴定 | 第44页 |
| 3.3 阳性转化子的PCR鉴定 | 第44页 |
| 3.4 阳性转化子测序鉴定 | 第44-45页 |
| 3.5 上清总蛋白浓度的BCA法检测 | 第45页 |
| 3.6 阳性转化子诱导表达产物的检测 | 第45-46页 |
| 3.7 诱导表达条件的优化 | 第46-49页 |
| 3.7.1 诱导时间的优化 | 第46-48页 |
| 3.7.2 诱导温度的优化 | 第48页 |
| 3.7.3 诱导甲醇浓度的优化 | 第48-49页 |
| 3.8 诱导产物的纯化及Western Blot分析 | 第49-50页 |
| 3.9 表达产物的生物活性研究 | 第50-51页 |
| 3.10 绵羊Kp53对生殖激素LH和FSH的影响 | 第51-52页 |
| 4 讨论 | 第52-56页 |
| 4.1 绵羊Kp53的诱导表达与纯化 | 第52-53页 |
| 4.2 诱导表达条件的优化 | 第53-54页 |
| 4.3 吻素对生殖激素LH和FSH的影响 | 第54-56页 |
| 5 结论与下一步研究建议 | 第56-57页 |
| 5.1 结论 | 第56页 |
| 5.2 下一步研究建议 | 第56-57页 |
| 参考文献 | 第57-63页 |
| 在读期间的学术成果 | 第63-64页 |
| 致谢 | 第64页 |
