| 摘要 | 第7-9页 |
| Abstract | 第9-10页 |
| 缩略词表(Abbreviation) | 第11-13页 |
| 第一章 前言 | 第13-24页 |
| 1.1 禽流感简介 | 第13-21页 |
| 1.1.1 禽流感病毒病原学 | 第15页 |
| 1.1.2 禽流感防控 | 第15-16页 |
| 1.1.3 禽流感病毒诱导鸡干扰素应答的研究进展 | 第16-21页 |
| 1.2 CRISPR/Cas系统简介 | 第21-22页 |
| 1.3 慢病毒载体系统 | 第22-24页 |
| 第二章 研究目的与意义 | 第24-25页 |
| 第三章 材料方法 | 第25-45页 |
| 3.1 实验材料 | 第25-29页 |
| 3.1.1 菌株、毒株、细胞及鸡胚 | 第25页 |
| 3.1.2 质粒 | 第25页 |
| 3.1.3 抗体 | 第25页 |
| 3.1.4 引物及sgRNA | 第25-26页 |
| 3.1.5 相关试剂配制 | 第26-28页 |
| 3.1.6 主要试验仪器 | 第28页 |
| 3.1.7 主要酶和试剂 | 第28-29页 |
| 3.2 实验方法 | 第29-45页 |
| 3.2.1 通过转染PX459质粒构建DF1细胞系 | 第29-30页 |
| 3.2.2 慢病毒包装条件的确定 | 第30-31页 |
| 3.2.3 慢病毒lenti-CRISPR-v2的包装及感染DF1细胞 | 第31-32页 |
| 3.2.4 以lentiCas9-Blast为骨架构建Cas9蛋白稳定表达的DF1细胞系 | 第32-35页 |
| 3.2.5 DF1-Cas9细胞系的功能研究 | 第35-41页 |
| 3.2.6 利用表达绿荧光VSV病毒筛选chmda5功能失活的细胞系 | 第41-42页 |
| 3.2.7 H9N2病毒增殖、细胞接种及血凝价测定 | 第42-43页 |
| 3.2.8 实时荧光定量PCR检测细胞因子 | 第43-44页 |
| 3.2.9 统计学分析 | 第44-45页 |
| 第四章 结果与分析 | 第45-64页 |
| 4.1 转染PX459质粒构建表达CRISPR/Cas9系统的DF1细胞系 | 第45-47页 |
| 4.1.1 嘌呤霉素杀死DF1细胞最小浓度的测定 | 第45-46页 |
| 4.1.2 DF1细胞系转染效率的分析 | 第46页 |
| 4.1.3 DF1细胞转染PX459质粒及细胞系的筛选 | 第46-47页 |
| 4.2 慢病毒包装条件的确定 | 第47-51页 |
| 4.3 lenti-CRISPR-v2慢病毒的包装及DF1细胞系的构建 | 第51页 |
| 4.4 稳定表达Cas9蛋白的DF1细胞系的构建 | 第51-55页 |
| 4.4.1 杀稻瘟菌素(blasticidin)杀死DF1细胞最小浓度的测定 | 第52页 |
| 4.4.2 lentiCas9-Blast慢病毒的包装及Cas9蛋白稳定表达细胞系的筛选检测 | 第52-53页 |
| 4.4.3 通过转染慢病毒骨架质粒构建表达Cas9蛋白的DF1细胞系 | 第53-55页 |
| 4.4.4 细胞系的纯化及WesternBlot检测 | 第55页 |
| 4.5 DF1-Cas9细胞系的功能验证 | 第55-59页 |
| 4.5.1 sgRNA重组质粒的构建 | 第56-57页 |
| 4.5.2 chmda5基因扩增 | 第57页 |
| 4.5.3 chmda5突变的检测 | 第57-58页 |
| 4.5.4 突变细胞chmda5基因克隆测序 | 第58-59页 |
| 4.6 利用表达绿色荧光VSV病毒筛选chmda5功能失活的DF1细胞系 | 第59-61页 |
| 4.6.1 VSV-GFP病毒在DF1细胞中增殖条件的确定 | 第59页 |
| 4.6.2 VSV-GFP病毒筛选chmda5敲除细胞系 | 第59-60页 |
| 4.6.3 DF1-?chmda5细胞系的chmda5基因测序 | 第60-61页 |
| 4.7 chmda5对H9N2诱导IFN-β影响的研究 | 第61-63页 |
| 4.7.1 DF1-Cas9细胞感染H9N2后IFN-β和PKR转录水平的检测 | 第61-62页 |
| 4.7.2 DF1-?chmda5细胞感染H9N2后IFN-β和PKR转录水平的检测 | 第62页 |
| 4.7.3 DF1-?chmda5和DF1-Cas9细胞感染H9N2后IFN-β和PKR转录水平的比较 | 第62-63页 |
| 4.8 H9N2病毒在DF1-?chmda5和DF1-Cas9细胞增殖过程中血凝素含量的检测 | 第63-64页 |
| 第五章 讨论 | 第64-67页 |
| 第六章 结论 | 第67-68页 |
| 参考文献 | 第68-76页 |
| 致谢 | 第76-77页 |
| 附录 | 第77-78页 |
