| 摘要 | 第4-5页 |
| ABSTRACT | 第5页 |
| 第1章 绪论 | 第10-19页 |
| 1.1 课题背景及研究目的意义 | 第10-11页 |
| 1.2 胶原蛋白概述 | 第11-17页 |
| 1.2.1 胶原蛋白的分类与分布 | 第11-12页 |
| 1.2.2 胶原蛋白的结构 | 第12-13页 |
| 1.2.3 胶原蛋白的应用 | 第13-14页 |
| 1.2.4 重组胶原蛋白的研究 | 第14-17页 |
| 1.3 研究内容和技术路线 | 第17-19页 |
| 1.3.1 主要研究内容 | 第17页 |
| 1.3.2 本文的技术路线 | 第17-19页 |
| 第2章 实验材料与实验方法 | 第19-35页 |
| 2.1 实验材料 | 第19-24页 |
| 2.1.1 目的基因 | 第19页 |
| 2.1.2 试剂与药品 | 第19-20页 |
| 2.1.3 仪器设备 | 第20-21页 |
| 2.1.4 试剂盒及酶 | 第21页 |
| 2.1.5 宿主菌和载体质粒 | 第21页 |
| 2.1.6 培养基的配制 | 第21-22页 |
| 2.1.7 主要试剂及其配制 | 第22-24页 |
| 2.2 构建含有col Ⅲ片段的重组质粒 | 第24-27页 |
| 2.2.1 优化设计人Ⅲ型胶原蛋白肽基因 | 第24页 |
| 2.2.2 重组质粒的构建与鉴定 | 第24-25页 |
| 2.2.3 质粒DNA的提取与鉴定 | 第25页 |
| 2.2.4 质粒DNA的酶切与连接 | 第25-26页 |
| 2.2.5 大肠杆菌感受态细胞制备与转化 | 第26-27页 |
| 2.3 构建嗜热链球菌工程菌 | 第27-29页 |
| 2.3.1 制备嗜热链球菌感受态细胞 | 第27-28页 |
| 2.3.2 嗜热链球菌感受态细胞的电转化 | 第28页 |
| 2.3.3 工程菌菌液PCR鉴定 | 第28-29页 |
| 2.3.4 PCR产物序列通测 | 第29页 |
| 2.4 胶原蛋白肽的表达验证与纯化 | 第29-32页 |
| 2.4.1 筛选最优细胞破碎方法 | 第29-30页 |
| 2.4.2 工程菌蛋白质表达鉴定 | 第30-31页 |
| 2.4.3 目标胶原肽Western Blot鉴定 | 第31页 |
| 2.4.4 目标胶原肽镍离子亲和层析 | 第31-32页 |
| 2.5 目标胶原肽的表达优化 | 第32-35页 |
| 2.5.1 比较嗜热链球菌空菌与工程菌的生长 | 第32页 |
| 2.5.2 考马斯亮蓝法测蛋白质浓度 | 第32页 |
| 2.5.3 菌液OD_(600)下的分光光度值与目标胶原肽浓度的关系 | 第32-33页 |
| 2.5.4 优化培养基 | 第33页 |
| 2.5.5 优化培养条件 | 第33-35页 |
| 第3章 构建嗜热链球工程菌 | 第35-46页 |
| 3.1 引言 | 第35页 |
| 3.2 本章实验内容 | 第35-36页 |
| 3.3 构建连接质粒pSBlc3-col Ⅲ-nisⅠ | 第36-38页 |
| 3.3.1 col Ⅲ与nisⅠ片段的查找、修饰与合成 | 第36-38页 |
| 3.3.2 连接质粒双酶切鉴定 | 第38页 |
| 3.4 构建重组质粒pMG36e-col Ⅲ-nisⅠ | 第38-40页 |
| 3.4.1 重组质粒琼脂糖电泳鉴定 | 第39页 |
| 3.4.2 重组质粒双酶切鉴定 | 第39-40页 |
| 3.5 构建嗜热链球工程菌 | 第40-45页 |
| 3.5.1 嗜热链球菌生长曲线 | 第40-41页 |
| 3.5.2 重组质粒电转入嗜热链球菌 | 第41-42页 |
| 3.5.3 菌液PCR结果 | 第42页 |
| 3.5.4 全序列通测 | 第42-45页 |
| 3.6 本章小结 | 第45-46页 |
| 第4章 胶原蛋白肽的表达、鉴定、纯化与发酵优化 | 第46-61页 |
| 4.1 引言 | 第46页 |
| 4.2 本章实验内容 | 第46-47页 |
| 4.3 目标胶原肽的表达、鉴定与纯化 | 第47-52页 |
| 4.3.1 筛选最优细胞破碎法 | 第47页 |
| 4.3.2 目标胶原肽的蛋白电泳 | 第47-49页 |
| 4.3.3 目标胶原蛋白肽纯化与鉴定 | 第49-52页 |
| 4.4 嗜热链球空菌与工程菌生长曲线比较 | 第52-53页 |
| 4.5 优化培养基与培养条件 | 第53-60页 |
| 4.5.1 考马斯亮蓝标准曲线 | 第53-54页 |
| 4.5.2 菌液OD_(600)下的分光光度值与蛋白质浓度的关系 | 第54-55页 |
| 4.5.3 葡萄糖浓度对工程菌生长的影响 | 第55-56页 |
| 4.5.4 蛋白胨浓度对菌体生长的影响 | 第56页 |
| 4.5.5 酵母提取物浓度对菌体生长的影响 | 第56-57页 |
| 4.5.6 接菌量浓度对菌体生长的影响 | 第57-58页 |
| 4.5.7 培养温度对菌体生长的影响 | 第58页 |
| 4.5.8 红霉素浓度对菌体生长的影响 | 第58-59页 |
| 4.5.9 优化后目标胶原蛋白肽的表达量 | 第59-60页 |
| 4.6 本章小结 | 第60-61页 |
| 结论 | 第61-63页 |
| 参考文献 | 第63-68页 |
| 附录 | 第68-72页 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文及其它成果 | 第72-74页 |
| 致谢 | 第74页 |
