| 摘要 | 第3-6页 |
| ABSTRACT | 第6-9页 |
| 第一章 前言 | 第14-20页 |
| 1.1 乳腺癌研究现状 | 第14-15页 |
| 1.2 肿瘤骨转移相关细胞因子和受体研究 | 第15-18页 |
| 1.3 SDF-1/CXCR4信号轴的研究现状 | 第18-19页 |
| 1.4 本研究的背景和意义 | 第19-20页 |
| 第二章 重组LentiCRISPRv2慢病毒质粒载体的构建 | 第20-37页 |
| 2.1 材料 | 第21-24页 |
| 2.1.1 菌株与质粒 | 第21页 |
| 2.1.2 主要试剂 | 第21-22页 |
| 2.1.3 主要仪器 | 第22页 |
| 2.1.4 实验室常规试剂与器材 | 第22-23页 |
| 2.1.5 常用试剂的配置 | 第23-24页 |
| 2.2 方法 | 第24-31页 |
| 2.2.1 sgRNA靶点选择及寡核苷酸链设计合成 | 第24-25页 |
| 2.2.2 Oligo退火反应 | 第25页 |
| 2.2.3 质粒酶切电泳及切胶回收 | 第25-26页 |
| 2.2.4 制备感受态细胞 | 第26页 |
| 2.2.5 连接 | 第26-27页 |
| 2.2.6 转化(热激法) | 第27页 |
| 2.2.7 挑菌接种及扩大培养 | 第27页 |
| 2.2.8 菌液PCR | 第27-28页 |
| 2.2.9 琼脂糖凝胶电泳 | 第28-29页 |
| 2.2.10 小提质粒测浓度并验证 | 第29-30页 |
| 2.2.11 质粒大量提取(Qiagen试剂盒) | 第30-31页 |
| 2.3 结果 | 第31-35页 |
| 2.3.1 sgRNA靶点及寡核苷酸链设计合成 | 第31-32页 |
| 2.3.2 LentiCRISPRv2-sgRNA载体菌液PCR电泳鉴定结果 | 第32-33页 |
| 2.3.3 重组真核表达质粒LentiCRISPRv2-sgRNA的测序鉴定结果 | 第33-34页 |
| 2.3.4 LentiCRISPRv2-sgRNA重组质粒琼脂糖凝胶电泳结果 | 第34-35页 |
| 2.4 讨论 | 第35-37页 |
| 第三章 稳定敲除CXCR4基因的4T1细胞株的构建 | 第37-61页 |
| 3.1 材料 | 第37-42页 |
| 3.1.1 细胞株 | 第37页 |
| 3.1.2 主要试剂 | 第37-39页 |
| 3.1.3 主要仪器 | 第39-40页 |
| 3.1.4 实验室常规试剂与器材 | 第40页 |
| 3.1.5 常用试剂的配置 | 第40-42页 |
| 3.2 方法 | 第42-52页 |
| 3.2.1 293T细胞的复苏传代及冻存 | 第42-44页 |
| 3.2.2 4T1细胞的复苏传代与冻存 | 第44-45页 |
| 3.2.3 慢病毒包装 | 第45页 |
| 3.2.4 病毒的收集 | 第45-46页 |
| 3.2.5 嘌呤霉素杀灭曲线的确定 | 第46页 |
| 3.2.6 慢病毒感染4T1细胞并进行嘌呤霉素筛选 | 第46页 |
| 3.2.7 利用有限稀释法进行单克隆筛选并测序 | 第46-47页 |
| 3.2.8 Trizol法提取RNA | 第47-48页 |
| 3.2.9 qRT-PCR检测4T1细胞CXCR4的mRNA的表达量 | 第48-50页 |
| 3.2.10 Western blot检测CXCR4蛋白的表达水平 | 第50-52页 |
| 3.3 结果 | 第52-59页 |
| 3.3.1 慢病毒包装荧光显示结果 | 第52-53页 |
| 3.3.2 嘌呤霉素杀灭曲线的确定 | 第53-55页 |
| 3.3.3 病毒感染4T1细胞后筛选阳性细胞结果 | 第55-56页 |
| 3.3.4 筛选成功的单克隆细胞测序结果 | 第56-58页 |
| 3.3.5 敲除CXCR4基因的细胞株mRNA的表达情况 | 第58-59页 |
| 3.3.6 免疫印迹法检测细胞株内CXCR4蛋白表达结果 | 第59页 |
| 3.4 讨论 | 第59-61页 |
| 第四章 敲除CXCR4基因对4T1细胞迁移侵袭能力影响的研究 | 第61-75页 |
| 4.1 材料 | 第61-63页 |
| 4.1.1 细胞 | 第61页 |
| 4.1.2 主要试剂 | 第61-62页 |
| 4.1.3 主要仪器 | 第62页 |
| 4.1.4 其他试剂耗材 | 第62页 |
| 4.1.5 常用试剂的配置 | 第62-63页 |
| 4.2 方法 | 第63-66页 |
| 4.2.1 细胞增殖活性检测 | 第63页 |
| 4.2.2 细胞划痕实验 | 第63-64页 |
| 4.2.3 利用Transwell法进行细胞迁移实验 | 第64-66页 |
| 4.2.4 统计学处理 | 第66页 |
| 4.3 结果 | 第66-73页 |
| 4.3.1 CCK-8检测细胞增殖活性结果 | 第66-67页 |
| 4.3.2 细胞划痕实验结果 | 第67-69页 |
| 4.3.3 细胞迁移实验结果 | 第69-73页 |
| 4.4 讨论 | 第73-75页 |
| 第五章 敲除CXCR4基因后乳腺癌细胞下游分子通路变化及骨转移相关因子相互作用的研究 | 第75-85页 |
| 5.1 材料 | 第76-77页 |
| 5.1.1 细胞株 | 第76页 |
| 5.1.2 主要试剂 | 第76-77页 |
| 5.1.3 主要仪器 | 第77页 |
| 5.1.4 实验室常规耗材与试剂 | 第77页 |
| 5.2 方法 | 第77-78页 |
| 5.2.1 用SDF-1处理4T1细胞后下游信号通路的研究 | 第77-78页 |
| 5.2.2 用不同浓度SDF-1处理乳腺癌细胞细胞后整合素αvβ3表达的研究 | 第78页 |
| 5.3 结果 | 第78-82页 |
| 5.3.1 SDF-1处理4T1细胞后下游信号分子表达情况 | 第78-80页 |
| 5.3.2 不同浓度SDF-1处理乳腺癌细胞细胞后整合素αvβ3表达的变化研究 | 第80-82页 |
| 5.4 讨论 | 第82-85页 |
| 全文总结 | 第85-86页 |
| 参考文献 | 第86-96页 |
| 中英文缩略词表 | 第96-97页 |
| 研究生期间获得的成果 | 第97-98页 |
| 致谢 | 第98-99页 |
