| 摘要 | 第8-10页 |
| Abstract | 第10-11页 |
| 1 引言 | 第12-19页 |
| 1.1 体细胞核移植 | 第12-13页 |
| 1.1.1 体细胞核移植技术 | 第12页 |
| 1.1.2 体细胞核移植技术存在的问题 | 第12-13页 |
| 1.2 转基因细胞系 | 第13页 |
| 1.3 MSTN基因概述 | 第13-15页 |
| 1.3.1 MSTN基因的生物学作用 | 第14页 |
| 1.3.2 MSTN基因缺失或突变造成双肌现象 | 第14-15页 |
| 1.4 转基因细胞系拷贝数的检测方法 | 第15页 |
| 1.4.1 实时荧光定量PCR法 | 第15页 |
| 1.4.2 Southern blot方法 | 第15页 |
| 1.5 转基因细胞系整合位点的检测方法 | 第15-18页 |
| 1.5.1 荧光原位杂交技术 | 第16页 |
| 1.5.2 个体基因组文库筛选法 | 第16页 |
| 1.5.3 IPCR方法 | 第16-17页 |
| 1.5.4 接头PCR | 第17页 |
| 1.5.5 锚定PCR | 第17页 |
| 1.5.6 高效热不对称互交式PCR(hi-TAIL-PCR) | 第17-18页 |
| 1.6 研究的目的与意义 | 第18-19页 |
| 2 材料与方法 | 第19-28页 |
| 2.1 实验材料 | 第19-21页 |
| 2.1.1 成纤维细胞及pGenesil-1.1-MSTN载体 | 第19页 |
| 2.1.2 转基因牛基因组 | 第19页 |
| 2.1.3 主要实验仪器 | 第19页 |
| 2.1.4 DNA分析软件 | 第19页 |
| 2.1.5 主要实验试剂及配制 | 第19-21页 |
| 2.2 实验方法 | 第21-28页 |
| 2.2.1 去内毒素质粒提取 | 第21页 |
| 2.2.2 牛成纤维细胞的培养及转染 | 第21-24页 |
| 2.2.3牛成纤维细胞转染G418浓度摸索 | 第24页 |
| 2.2.4 获得转MSTN干扰载体阳性细胞系 | 第24页 |
| 2.2.5 绝对定量PCR检测外源基因的拷贝数 | 第24-25页 |
| 2.2.6 hiTAIL-PCR对整合位点的克隆 | 第25-28页 |
| 3 结果与分析 | 第28-38页 |
| 3.1 牛成纤维细胞转染条件优化的结果 | 第28-30页 |
| 3.1.1 脂质体2000转染条件优化 | 第28页 |
| 3.1.2 PEI法转染条件优化 | 第28-30页 |
| 3.1.3 线性化质粒细胞转染条件的优化 | 第30页 |
| 3.2 获得MSTN转基因单克隆细胞株 | 第30-31页 |
| 3.3 单克隆细胞株外源基因拷贝数和整合位点的检测结果 | 第31-34页 |
| 3.3.1 定量PCR标准曲线 | 第31-32页 |
| 3.3.2 转基因细胞系拷贝数的鉴定 | 第32-33页 |
| 3.3.3 扩增外源基因整合位点 | 第33页 |
| 3.3.4 转基因细胞系整合位点的序列分析 | 第33-34页 |
| 3.4 转基因牛中外源基因拷贝数与整合位点的检测 | 第34-36页 |
| 3.4.1 定量PCR标准曲线 | 第34-35页 |
| 3.4.2 转基因牛拷贝数的鉴定 | 第35-36页 |
| 3.4.3 转基因牛整合位点的序列分析 | 第36页 |
| 3.5 检测外源基因整合位点的分析 | 第36-38页 |
| 4 讨论 | 第38-41页 |
| 4.1 成纤维细胞转染 | 第38页 |
| 4.2 G418药物筛选 | 第38-39页 |
| 4.3 外源基因拷贝数的检测 | 第39页 |
| 4.4 外源基因整合位点的检测 | 第39-40页 |
| 4.5 转基因细胞系的检测与转基因动物生产 | 第40-41页 |
| 5 结论 | 第41-42页 |
| 致谢 | 第42-43页 |
| 参考文献 | 第43-48页 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 | 第48页 |
