| 摘要 | 第4-7页 |
| ABSTRACT | 第7-9页 |
| 第一章 绪论 | 第15-27页 |
| 1.1 引言 | 第15页 |
| 1.2 3-羟基丙酸的合成方法 | 第15-16页 |
| 1.3 甘油代谢产3-羟基丙酸途径的关键酶 | 第16-18页 |
| 1.3.1 甘油脱水酶 | 第16-17页 |
| 1.3.2 醛脱氢酶 | 第17-18页 |
| 1.4 基因工程菌的研究进展 | 第18-22页 |
| 1.4.1 以E.coli作为宿主合成3-HP | 第19-21页 |
| 1.4.2 以K. pneumoniae作为宿主合成3-HP | 第21-22页 |
| 1.4.3 目前面临的挑战 | 第22页 |
| 1.5 基因敲除技术的原理及方法 | 第22-24页 |
| 1.5.1 RecA同源重组 | 第22-23页 |
| 1.5.2 λ-Red重组系统 | 第23页 |
| 1.5.3 同源重组片段的构建 | 第23-24页 |
| 1.6 本论文选题依据与研究内容 | 第24-27页 |
| 第二章 3-羟基丙酸合成关键酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达 | 第27-55页 |
| 2.1 引言 | 第27页 |
| 2.2 材料与方法 | 第27-44页 |
| 2.2.1 菌株与质粒 | 第27-28页 |
| 2.2.2 培养基 | 第28-29页 |
| 2.2.3 主要工具酶和试剂 | 第29页 |
| 2.2.4 主要实验仪器 | 第29页 |
| 2.2.5 实验方法 | 第29-44页 |
| 2.2.5.1 质粒的提取 | 第29-30页 |
| 2.2.5.2 基因组DNA的提取 | 第30-31页 |
| 2.2.5.3 大肠杆菌感受态的制备 | 第31-32页 |
| 2.2.5.4 酶切产物的转化（热击法） | 第32页 |
| 2.2.5.5 甘油脱水酶表达载体的构建 | 第32-35页 |
| 2.2.5.6 甘油脱水酶酶活检测 | 第35-37页 |
| 2.2.5.7 醛脱氢酶表达载体构建 | 第37-40页 |
| 2.2.5.8 醛脱氢酶酶活检测 | 第40-41页 |
| 2.2.5.9 甘油脱水酶/醛脱氢酶共表达载体的构建 | 第41页 |
| 2.2.5.10 共表达菌株发酵 | 第41页 |
| 2.2.5.11 分析方法 | 第41-44页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第44-53页 |
| 2.3.1 甘油脱水酶基因在大肠杆菌中的表达 | 第44-48页 |
| 2.3.1.1 甘油脱水酶表达载体的构建 | 第44页 |
| 2.3.1.2 甘油脱水酶表达载体菌落PCR结果 | 第44-45页 |
| 2.3.1.3 单双酶切鉴定甘油脱水酶表达载体 | 第45-46页 |
| 2.3.1.4 甘油脱水酶表达产物SDS-PAGE分析 | 第46-47页 |
| 2.3.1.5 甘油脱水酶酶活的测定 | 第47-48页 |
| 2.3.2 醛脱氢酶基因在大肠杆菌中的表达 | 第48-50页 |
| 2.3.2.1 醛脱氢酶表达载体的构建 | 第48页 |
| 2.3.2.2 醛脱氢酶表达载体菌落PCR结果 | 第48-49页 |
| 2.3.2.3 双酶切鉴定醛脱氢酶表达载体 | 第49-50页 |
| 2.3.2.4 醛脱氢酶表达产物SDS-PAGE分析 | 第50页 |
| 2.3.2.5 醛脱氢酶酶活的测定 | 第50页 |
| 2.3.3 共表达菌株的发酵 | 第50-53页 |
| 2.4 本章小结 | 第53-55页 |
| 第三章 NAD+再生基因的表达对3-羟基丙酸合成的影响 | 第55-71页 |
| 3.1 引言 | 第55页 |
| 3.2 材料与方法 | 第55-62页 |
| 3.2.1 菌种及质粒 | 第55-56页 |
| 3.2.2 培养基 | 第56页 |
| 3.2.3 主要工具酶和试剂 | 第56页 |
| 3.2.4 主要实验仪器 | 第56页 |
| 3.2.5 实验方法 | 第56-62页 |
| 3.2.5.1 酿酒酵母S.cerevisiae中甘油三磷酸脱氢酶的克隆与表达 | 第56-59页 |
| 3.2.5.2 吡啶核苷酸转氢酶（PntAB或UdhA）的克隆与表达 | 第59-61页 |
| 3.2.5.3 醛脱氢酶酶活检测 | 第61页 |
| 3.2.5.4 共表达菌株的构建 | 第61-62页 |
| 3.2.5.5 共表达菌株的摇瓶发酵 | 第62页 |
| 3.2.5.6 分析方法 | 第62页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第62-68页 |
| 3.3.1 甘油三磷酸脱氢酶在大肠杆菌中的表达 | 第62-64页 |
| 3.3.1.1 甘油三磷酸脱氢酶表达载体的构建 | 第62-63页 |
| 3.3.1.2 甘油三磷酸脱氢酶表达载体菌落PCR结果 | 第63-64页 |
| 3.3.1.3 单双酶切鉴定甘油三磷酸脱氢酶表达载体 | 第64页 |
| 3.3.2 吡啶核苷酸转氢酶(PntAB或UdhA)在大肠杆菌中的表达 | 第64-66页 |
| 3.3.2.1 吡啶核苷酸转氢酶表达载体的构建 | 第64-65页 |
| 3.3.2.2 吡啶核苷酸转氢酶表达载体菌落PCR结果 | 第65-66页 |
| 3.3.2.3 单双酶切鉴定吡啶核苷酸转氢酶表达载体 | 第66页 |
| 3.3.3 醛脱氢酶酶活的测定 | 第66-67页 |
| 3.3.4 共表达菌株的发酵 | 第67-68页 |
| 3.4 本章小结 | 第68-71页 |
| 第四章 大肠杆菌乙醛脱氢酶基因（yqhD）及甘油抑制因子基因（glpR）的敲除 | 第71-91页 |
| 4.1 引言 | 第71-72页 |
| 4.2 材料与方法 | 第72-79页 |
| 4.2.1 菌株和质粒 | 第72页 |
| 4.2.2 培养基 | 第72页 |
| 4.2.3 主要工具酶和试剂 | 第72页 |
| 4.2.4 主要实验仪器 | 第72页 |
| 4.2.5 实验方法 | 第72-79页 |
| 4.2.5.1 电击转化感受态的制备 | 第72-73页 |
| 4.2.5.2 电击转化 | 第73页 |
| 4.2.5.3 消除kan抗性基因 | 第73页 |
| 4.2.5.4 大肠杆菌乙醛脱氢酶基因（yqhD）的敲除 | 第73-76页 |
| 4.2.5.5 大肠杆菌甘油抑制因子基因（glpR）的敲除 | 第76-78页 |
| 4.2.5.6 共表达双质粒基因敲除菌的构建 | 第78-79页 |
| 4.2.5.7 共表达敲除菌的发酵 | 第79页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第79-89页 |
| 4.3.1 乙醛脱氢酶基因（yqhD）的敲除 | 第79-80页 |
| 4.3.1.1 菌落PCR筛选阳性克隆E.coliW3110_yqhD::kan | 第79-80页 |
| 4.3.1.2 菌落PCR筛选阳性克隆E.coliW3110_?yqhD | 第80页 |
| 4.3.2 甘油抑制因子基因（glpR）的敲除 | 第80-82页 |
| 4.3.2.1 菌落PCR筛选阳性克隆E.coliW3110_glpR::kan | 第80-81页 |
| 4.3.2.2 菌落PCR筛选阳性克隆E.coliW3110_?glpR | 第81-82页 |
| 4.3.3 工程菌株的验证 | 第82-84页 |
| 4.3.3.1 E.coliW3110_?yqhD(pCDFDuet-tac-TUkgsadh/pACYCDuet-tac-dhaB1-4) | 第82-83页 |
| 4.3.3.2 E.coliW3110_?yqhD(pCDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh/pACYCDuet-tac-dhaB1-4)菌株的验证 | 第83-84页 |
| 4.3.3.3 E.coliW3110_?glpR(pCDFDuet-tac-TUkgsadh/p ACYCDuet-tac-dhaB1-4)、E.coliW3110_?glpR (pCDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh/ pACYCDuet-tac-dhaB1-4)、E.coliW3110(pCDFDuet-tac-TUkgsadh/pACYCDuet-tac-dhaB1-4)、E.coli W3110(pCDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh/p ACYCDuet-tac | 第84页 |
| 4.3.4 工程菌摇瓶发酵结果 | 第84-89页 |
| 4.3.4.1 yqhD基因的敲除对3-HP生产的影响 | 第84-85页 |
| 4.3.4.2 glpR基因的敲除对3-HP生产的影响 | 第85-86页 |
| 4.3.4.3 过表达辅酶再生基因对敲除菌生产 3-HP的影响 | 第86-89页 |
| 4.4 本章小结 | 第89-91页 |
| 第五章 结论与展望 | 第91-95页 |
| 5.1 结论 | 第91-93页 |
| 5.2 展望 | 第93-95页 |
| 参考文献 | 第95-103页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第103-105页 |
| 致谢 | 第105-107页 |
| 附录 | 第107-110页 |
