| Abstract | 第9-10页 |
| Abbreviations | 第11-12页 |
| 1 Introduction | 第12-30页 |
| 1.1 Enzyme | 第12页 |
| 1.2 Esterase | 第12-30页 |
| 1.2.1 Structure of esterases | 第13-14页 |
| 1.2.2 Catalytic mechanism of esterase/lipase | 第14-16页 |
| 1.2.3 Interfacial activation of esterases/lipases | 第16页 |
| 1.2.4 Classification of esterases/lipases | 第16-20页 |
| 1.2.5 Applications of esterases/lipases | 第20-22页 |
| 1.2.5.1 Food Industry | 第21页 |
| 1.2.5.2 Industrial detergent | 第21页 |
| 1.2.5.3 Pharmaceutical Industry | 第21-22页 |
| 1.2.5.4 Biodiesel | 第22页 |
| 1.2.5.5 Paper Industry | 第22页 |
| 1.2.6 Detection of esterase activity | 第22-23页 |
| 1.2.7 Sources of esterases | 第23页 |
| 1.2.8 Psychrophiles | 第23-26页 |
| 1.2.8.1 Salt tolerant enzymes | 第24页 |
| 1.2.8.2 Cold active enzymes | 第24-26页 |
| 1.2.8.2.1 Structure of cold active enzyme | 第25页 |
| 1.2.8.2.2 Applications of cold active enzymes | 第25-26页 |
| 1.2.9 Enzyme Immobilization | 第26-27页 |
| 1.2.10 Matrix for immobilization | 第27-28页 |
| 1.2.11 Applications of immobilization | 第28-29页 |
| 1.2.12 Purpose and significance of this research | 第29-30页 |
| 2 Materials and methods | 第30-47页 |
| 2.1 Materials | 第30-33页 |
| 2.1.1 Strains and plasmids | 第30页 |
| 2.1.2 Reagents | 第30页 |
| 2.1.3 Medium | 第30-31页 |
| 2.1.4 Solutions | 第31-32页 |
| 2.1.5 Equipment | 第32-33页 |
| 2.2 Cloning of esterase gene | 第33-37页 |
| 2.2.1 Genomic DNA extraction of Zunongwangia Profunda | 第33页 |
| 2.2.2 Esterase gene was amplified by PCR | 第33-34页 |
| 2.2.2.1 Amplification of gene for EstLiu | 第33-34页 |
| 2.2.2.2 Amplification of gene for EstH | 第34页 |
| 2.2.3 PCR products purification and digestion | 第34-35页 |
| 2.2.4 p GEX-6p-1 vector preparation | 第35页 |
| 2.2.5 Ligation reaction | 第35页 |
| 2.2.6 Preparation of E. coli competent cell | 第35-36页 |
| 2.2.7 Electroporation | 第36页 |
| 2.2.8 Detection of positive clones | 第36-37页 |
| 2.3 Expression and purification of esterases | 第37-40页 |
| 2.3.1 Expression and purification of EstLiu and EstH | 第37-38页 |
| 2.3.2 Protein analysis by SDS-PAGE | 第38-39页 |
| 2.3.3 Protein concentration determination | 第39-40页 |
| 2.4 Enzymatic Properties Determination | 第40-44页 |
| 2.4.1 Standard curve drawing | 第40页 |
| 2.4.2 Enzymatic activity measurement | 第40-41页 |
| 2.4.2.1 EstLiu activity measurement | 第40页 |
| 2.4.2.2 EstLiu activity measurement | 第40-41页 |
| 2.4.3 Determination of substrate specificity | 第41页 |
| 2.4.4 Determination of optimum temperature | 第41页 |
| 2.4.5 Determination of temperature stability | 第41-42页 |
| 2.4.5.1 Determination of temperature stability of EstLiu | 第41页 |
| 2.4.5.2 Determination of temperature stability of EstH | 第41-42页 |
| 2.4.6 Optimal pH measurement | 第42页 |
| 2.4.7 Determination of pH stability | 第42-43页 |
| 2.4.8 Effect of metal ions and other chemicals on the activity of Est Liu | 第43页 |
| 2.4.9 Effect of different organic solvents on the esterase activity | 第43页 |
| 2.4.10 Effect of different detergents on esterase activity | 第43页 |
| 2.4.11 Effect of high concentrations of NaCl solution in esterase activity andstability | 第43-44页 |
| 2.5 Immobilization | 第44-46页 |
| 2.5.1 Synthesis of Fe3O4~cellulose nano-composite | 第44-45页 |
| 2.5.2 Characterization of Fe3O4~cellulose nano-composite | 第45页 |
| 2.5.3 Immobilization of purified esterase onto Fe3O4~cellulose nano-composite | 第45页 |
| 2.5.4 Determination of reusability and storage stability of immobilized Est H | 第45-46页 |
| 2.5.4.1 Reusability | 第45页 |
| 2.5.4.2 Storage ability | 第45-46页 |
| 2.6 Sequence analysis | 第46页 |
| 2.7 Kinetic parameters | 第46页 |
| 2.8 Structural modeling | 第46-47页 |
| 3 Results | 第47-73页 |
| 3.1 Genomic DNA Extraction of Zunongwangia Profunda | 第47页 |
| 3.2 PCR amplification of esterase genes | 第47-49页 |
| 3.2.1 PCR amplification of EstLiu | 第47-48页 |
| 3.2.2 PCR amplification of EstH | 第48-49页 |
| 3.3 Recombinant plasmid Construction | 第49-50页 |
| 3.3.1 Recombinant plasmid of pGEX-6p1Est Liu Construction | 第49页 |
| 3.3.2 Recombinant plasmid of pGEX-6p1EstH Construction | 第49-50页 |
| 3.4 Sequence analysis of the esterases | 第50-51页 |
| 3.4.1 Sequence analysis of EstLiu | 第50页 |
| 3.4.2 Sequence analysis of EstH | 第50-51页 |
| 3.5 Expression and purification of proteins | 第51-55页 |
| 3.5.1 Expression and purification of EstLiu | 第51页 |
| 3.5.2 Expression and purification of EstH | 第51-55页 |
| 3.6 Synthesis and characterization of Fe_3O_4~cellulose nano-composite | 第55-56页 |
| 3.7 Immobilization of purified esterase onto Fe3O4~ cellulose nano-composite | 第56-57页 |
| 3.8 Characterization of EstLiu and EstH | 第57-73页 |
| 3.8.1 Product standard curve preparation | 第57-58页 |
| 3.8.2 Determination of substrate specificity | 第58-59页 |
| 3.8.2.1 Determination of substrate specificity of EstLiu | 第58-59页 |
| 3.8.2.2 Determination of substrate specificity of EstH | 第59页 |
| 3.8.3 Effect of temperature on the enzyme activity and stability | 第59-61页 |
| 3.8.3.1 Effect of temperature on the activity and stability of EstLiu | 第59-60页 |
| 3.8.3.2 Effect of temperature on the activity and stability of EstH | 第60-61页 |
| 3.8.4 Effect of pH on the activity and stability | 第61-63页 |
| 3.8.4.1 Effect of pH on the activity and stability of Est Liu | 第61-62页 |
| 3.8.4.2 Effect of pH on the activity and stability of EstH | 第62-63页 |
| 3.8.5 Effect of metal ions on the activity of esterase | 第63-64页 |
| 3.8.5.1 Effect of metal ions on the activity of EstLiu | 第63页 |
| 3.8.5.2 Effect of metal ions on the activity of EstH | 第63-64页 |
| 3.8.6 Effect of organic solvents on the esterase activity | 第64-66页 |
| 3.8.6.1 Effect of organic solvents on the activity of EstLiu | 第64页 |
| 3.8.6.2 Effect of organic solvents on the activity of EstH | 第64-66页 |
| 3.8.7 Effect of detergents and other chemicals on the esterase activity | 第66-67页 |
| 3.8.7.1 Effect of detergents and other chemicals on the activity of EstLiu | 第66页 |
| 3.8.7.2 Effect of detergents on the activity of EstH | 第66-67页 |
| 3.8.8 Effect of Na Cl on the activity and stability of esterase | 第67-68页 |
| 3.8.9 Reusability assay of immobilized EstH | 第68页 |
| 3.8.10 Storage ability determination of immobilized EstH | 第68-70页 |
| 3.8.11 Kinetic parameters of esterase | 第70页 |
| 3.8.11.1 Kinetic parameters of EstLiu | 第70页 |
| 3.8.11.2 Kinetic parameters of EstH | 第70页 |
| 3.8.12 Structural modeling of esterases | 第70-73页 |
| 3.8.12.1 Structural modeling of EstLiu | 第70页 |
| 3.8.12.2 Structural modeling of EstH | 第70-73页 |
| 4 Discussion | 第73-81页 |
| 5 Conclusion | 第81-82页 |
| References | 第82-97页 |
| Publications | 第97页 |
| Awards | 第97-98页 |
| 附件 | 第98-101页 |
| ACKNOWLEDGEMENTS | 第101页 |
