| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-7页 |
| 第一章 文献综述 | 第13-28页 |
| 1.1 尼古丁简介 | 第13-14页 |
| 1.1.1 尼古丁的性质 | 第13页 |
| 1.1.2 尼古丁的来源和用途 | 第13-14页 |
| 1.2 尼古丁的污染及危害 | 第14-15页 |
| 1.2.1 尼古丁的污染 | 第14页 |
| 1.2.2 尼古丁对人类的危害 | 第14-15页 |
| 1.3 微生物降解尼古丁的研究现状 | 第15-18页 |
| 1.3.1 降解尼古丁的微生物 | 第16-17页 |
| 1.3.2 尼古丁降解过程中的颜色反应 | 第17-18页 |
| 1.4 尼古丁的代谢途径及其分子机制 | 第18-25页 |
| 1.4.1 吡啶途径及其分子机制 | 第18-21页 |
| 1.4.2 吡咯烷途径及其分子机制 | 第21-24页 |
| 1.4.3 吡啶和吡咯烷交叉途径 | 第24页 |
| 1.4.4 脱甲基途径 | 第24-25页 |
| 1.5 尼古丁降解菌的生物技术应用 | 第25-26页 |
| 1.5.1 尼古丁降解菌降解尼古丁的最佳条件 | 第25页 |
| 1.5.2 尼古丁代谢中间产物应用 | 第25-26页 |
| 1.6 本研究的目的、意义和主要内容 | 第26-28页 |
| 1.6.1 研究的目的和意义 | 第26-27页 |
| 1.6.2 研究的主要内容 | 第27-28页 |
| 第二章 尼古丁降解菌Shinella sp. HZN7的筛选和鉴定 | 第28-36页 |
| 2.1 实验材料 | 第28-29页 |
| 2.1.1 菌种、试剂和所用仪器 | 第28-29页 |
| 2.1.2 培养基 | 第29页 |
| 2.2 实验方法 | 第29-33页 |
| 2.2.1 尼古丁降解菌株的富集、纯化和分离 | 第29-30页 |
| 2.2.2 菌株的培养特征和生理生化特性的测定 | 第30页 |
| 2.2.3 菌株16S rDNA序列的测定和鉴定 | 第30-33页 |
| 2.2.3.1 菌株基因组DNA提取 | 第30页 |
| 2.2.3.2 菌株16S rRNA基因的PCR扩增 | 第30-31页 |
| 2.2.3.3 菌株16S rRNA基因PCR产物的回收和T/A克隆 | 第31页 |
| 2.2.3.4 感受态细胞的制备与酶连产物的转化 | 第31-32页 |
| 2.2.3.5 质粒DNA的提取 | 第32页 |
| 2.2.3.6 16S rRNA序列测定和菌株系统发育地位的确定 | 第32-33页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第33-35页 |
| 2.3.1 尼古丁降解菌的筛选、分离和纯化 | 第33页 |
| 2.3.2 菌株HZN7的培养特征及生理生化特性 | 第33-34页 |
| 2.3.3 菌株HZN7的测序结果及系统发育地位的确定 | 第34-35页 |
| 2.4 本章小结 | 第35-36页 |
| 第三章 Shinella sp. HZN7的降解特性及代谢途径研究 | 第36-46页 |
| 3.1 实验材料 | 第36-37页 |
| 3.1.1 菌株、试剂和所用仪器 | 第36-37页 |
| 3.1.2 培养基 | 第37页 |
| 3.2 实验方法 | 第37-39页 |
| 3.2.1 菌株Shinella sp. HZN7种子液制备 | 第37页 |
| 3.2.2 尼古丁含量测定 | 第37页 |
| 3.2.3 不同pH值下菌株对尼古丁的降解 | 第37-38页 |
| 3.2.4 不同温度下菌株对尼古丁的降解 | 第38页 |
| 3.2.5 不同接菌量下菌株对尼古丁的降解 | 第38页 |
| 3.2.6 不同初始尼古丁浓度下菌株对尼古丁的降解 | 第38页 |
| 3.2.7 尼古丁及其代谢中间产物的检测方法 | 第38-39页 |
| 3.3 实验结果与分析 | 第39-45页 |
| 3.3.1 pH值对菌株Shinella sp. HZN7降解尼古丁的影响 | 第39页 |
| 3.3.2 温度对菌株Shinella sp. HZN7降解尼古丁的影响 | 第39-40页 |
| 3.3.3 接种量对菌株Shinella sp. HZN7降解尼古丁的影响 | 第40-41页 |
| 3.3.4 尼古丁初始浓度对菌株Shinella sp. HZN7降解尼古丁的影响 | 第41页 |
| 3.3.5 代谢中间产物测定 | 第41-44页 |
| 3.3.6 Shinella sp. HZN7降解途径推测 | 第44-45页 |
| 3.4 本章小节 | 第45-46页 |
| 第四章 转座子突变文库的构建与筛选 | 第46-55页 |
| 4.1 实验材料 | 第46-47页 |
| 4.1.1 菌株、试剂和仪器 | 第46-47页 |
| 4.1.2 培养基 | 第47页 |
| 4.2 实验方法 | 第47-49页 |
| 4.2.1 菌株诱变前培养 | 第47页 |
| 4.2.2 转座子诱变 | 第47-48页 |
| 4.2.3 转座子突变株的筛选 | 第48页 |
| 4.2.4 失活突变株降解尼古丁的验证 | 第48-49页 |
| 4.2.5 突变株降解液的检测 | 第49页 |
| 4.3 实验结果与讨论 | 第49-54页 |
| 4.3.1 菌株HZN7诱变最适条件 | 第49页 |
| 4.3.2 菌株HZN7插入突变效率 | 第49-50页 |
| 4.3.3 代表性转座子突变株的初步分析 | 第50-54页 |
| 4.3.3.1 a型突变株 | 第50-51页 |
| 4.3.3.2 b型突变株 | 第51页 |
| 4.3.3.3 c型突变株 | 第51-52页 |
| 4.3.3.4 d型突变株 | 第52-53页 |
| 4.3.3.5 e型突变株 | 第53-54页 |
| 4.4 本章小结 | 第54-55页 |
| 第五章 降解途径的验证和其中一株突变株缺失基因的克隆及功能分析 | 第55-73页 |
| 5.1 实验材料 | 第55-58页 |
| 5.1.1 菌株、试剂和仪器 | 第55-58页 |
| 5.1.2 培养基 | 第58页 |
| 5.2 实验方法 | 第58-66页 |
| 5.2.1 6HN,6HMM、6HPON和HSP的制备 | 第58页 |
| 5.2.2 菌株HZN7及其突变株对各种中间产物的降解 | 第58页 |
| 5.2.3 转座子突变基因的克隆 | 第58-60页 |
| 5.2.4 克隆序列的测定、组装和分析 | 第60-61页 |
| 5.2.5 orf2基因的敲除 | 第61-66页 |
| 5.2.5.1 基因片段的敲除及同源重组片段的构建 | 第61-63页 |
| 5.2.5.2 构建同源重组载体 | 第63-64页 |
| 5.2.5.3 基因敲除重组子的获得 | 第64页 |
| 5.2.5.4 orf2基因功能 | 第64-66页 |
| 5.3 结果与分析 | 第66-70页 |
| 5.3.1 菌株HZN7及其突变株降解分析 | 第66页 |
| 5.3.2 降解途径的确定 | 第66-67页 |
| 5.3.3 SEFA-PCR克隆突变株N7-X5突变基因的分析 | 第67-69页 |
| 5.3.4 基因的敲除与功能互补分析 | 第69-70页 |
| 5.4 讨论 | 第70-72页 |
| 5.4.1 降解途径 | 第70-71页 |
| 5.4.2 突变株的选择 | 第71页 |
| 5.4.3 新代谢产物的预测 | 第71-72页 |
| 5.5 本章小结 | 第72-73页 |
| 第六章 论文总结 | 第73-76页 |
| 6.1 研究内容 | 第73-74页 |
| 6.2 创新点 | 第74页 |
| 6.3 不足与展望 | 第74-76页 |
| 参考文献 | 第76-88页 |
| 附录 | 第88-89页 |
| 致谢 | 第89-90页 |
| 攻读学位期间的研究成果 | 第90页 |
| 发表的文章 | 第90页 |
| 专利 | 第90页 |
