| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 1 前言 | 第9-24页 |
| 1.1 柱花草及其产业现状 | 第9页 |
| 1.2 柱花草炭疽病的起源、分布及危害情况 | 第9-10页 |
| 1.3 柱花草炭疽病的防治及存在问题 | 第10-11页 |
| 1.4 柱花草炭疽病及其研究现状 | 第11-13页 |
| 1.4.1 病原菌及其分类 | 第11-12页 |
| 1.4.2 柱花草炭疽病发生条件及侵染方式 | 第12页 |
| 1.4.3 炭疽病致病相关基因的研究 | 第12-13页 |
| 1.5 炭疽菌转化研究进展 | 第13-16页 |
| 1.5.1 炭疽菌早期的转化方法 | 第13-14页 |
| 1.5.2 T-DNA插入及其研究进展 | 第14-16页 |
| 1.6 获得T-DNA侧翼序列的研究方法 | 第16-22页 |
| 1.6.1 质拉拯救(plasmid rescue)法 | 第16-17页 |
| 1.6.2 反向PCR(inverse or inverted PCR,IPCR)法 | 第17页 |
| 1.6.3 PCR步移,PCR-Walking | 第17页 |
| 1.6.4 外源接头PCR | 第17-18页 |
| 1.6.5 突变位点扩增法(Amplification ofinsertion mutagenised sites,AIMS) | 第18页 |
| 1.6.6 Sequence-based分离法 | 第18页 |
| 1.6.7 连接介导PCR(Ligation-mediated PCR,LM-PCR) | 第18页 |
| 1.6.8 热不对称交错PCR(Thermal Asymmetric Interlaced PCR,TAIL-PCR) | 第18-22页 |
| 1.7 本研究目的、意义和内容 | 第22-23页 |
| 1.8 技术路线 | 第23-24页 |
| 2. 材料和方法 | 第24-41页 |
| 2.1 试验材料 | 第24-27页 |
| 2.1.1 供试菌株和质粒 | 第24页 |
| 2.1.2 培养基 | 第24-25页 |
| 2.1.3 抗生素及生化试剂 | 第25-26页 |
| 2.1.4 器材 | 第26-27页 |
| 2.2 方法 | 第27-41页 |
| 2.2.1. 柱花草炭疽菌遗传转化的体系优化 | 第27-28页 |
| 2.2.2. 柱花草炭疽菌突变体库的建立及评价 | 第28-33页 |
| 2.2.3 突变体的表型分析 | 第33-34页 |
| 2.2.4 柱花草炭疽菌致病缺陷突变子的筛选模型 | 第34-36页 |
| 2.2.5 转化子致病力检测 | 第36-37页 |
| 2.2.6 致病缺陷突变菌株T-DNA侧翼序列的扩增和克隆 | 第37-41页 |
| 3 结果与分析 | 第41-59页 |
| 3.1 柱花草炭疽菌遗传转化的体系优化 | 第41-45页 |
| 3.1.1 氯嘧磺隆的最佳使用浓度 | 第41页 |
| 3.1.2 受体材料对转化的影响 | 第41-42页 |
| 3.1.3 诱导时间对转化的影响 | 第42-43页 |
| 3.1.4 乙酰丁香酮(AS)对转化的影响 | 第43页 |
| 3.1.5 共培养时间对转化的影响 | 第43-44页 |
| 3.1.6 共培养时温度对转化的影响 | 第44-45页 |
| 3.2 柱花草炭疽菌突变体库的评价 | 第45-52页 |
| 3.2.1 PCR验证 | 第45-46页 |
| 3.2.2 转化子分生孢子的荧光验证 | 第46页 |
| 3.2.3 T-DNA插入突变体拷贝数分析 | 第46-47页 |
| 3.2.4 转化子的形态观察 | 第47-49页 |
| 3.2.5 转化子的生长速度 | 第49页 |
| 3.2.6 转化子的产孢量以及显微观察 | 第49-50页 |
| 3.2.7 转化子的遗传稳定性 | 第50-51页 |
| 3.2.8 分生孢子萌发以及附着胞的形成 | 第51-52页 |
| 3.3 柱花草炭疽菌致病缺陷突变子的筛选模型 | 第52-59页 |
| 3.3.1 初筛及复筛的接种方法 | 第52页 |
| 3.3.2 转化菌株在离体叶片针刺菌饼接种 | 第52-53页 |
| 3.3.3 致病力测定的初筛 | 第53页 |
| 3.3.4 致病力测定的复筛 | 第53-54页 |
| 3.3.5 致病缺陷突变体的PCR检测 | 第54页 |
| 3.3.6 TAIL-PCR获得突变体的侧翼序列 | 第54-59页 |
| 4 讨论 | 第59-63页 |
| 4.1 ATMT法在柱花草炭疽菌CH008高效遗传转化体系中的应用 | 第59-61页 |
| 4.2 柱花草炭疽菌突变体库的构建及评价分析 | 第61-62页 |
| 4.3 柱花草炭疽菌致病缺陷突变子的筛选 | 第62页 |
| 4.4 致病缺陷突变体的侧翼序列分析 | 第62-63页 |
| 5 结论 | 第63-64页 |
| 参考文献 | 第64-74页 |
| 致谢 | 第74页 |
