| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 目录 | 第7-11页 |
| 第一章 绪论 | 第11-28页 |
| 1.1 L-赖氨酸简介 | 第11-12页 |
| 1.1.1 L-赖氨酸的结构及理化性质 | 第11页 |
| 1.1.2 L-赖氨酸的功能及用途 | 第11-12页 |
| 1.2 L-赖氨酸的生产 | 第12-14页 |
| 1.2.1 L-赖氨酸生产现状 | 第12-13页 |
| 1.2.2 L-赖氨酸的生产方法 | 第13-14页 |
| 1.3 微生物发酵法生产 L-赖氨酸 | 第14-25页 |
| 1.3.1 L-赖氨酸生产菌株 | 第14页 |
| 1.3.2 L-赖氨酸生物合成途径 | 第14-15页 |
| 1.3.3 L-赖氨酸合成中关键性酶活性调节 | 第15-22页 |
| 1.3.4 国内外 L-赖氨酸菌种选育情况 | 第22-25页 |
| 1.4 立题背景和主要研究内容 | 第25-28页 |
| 1.4.1 立题背景 | 第25-26页 |
| 1.4.2 主要研究内容 | 第26-28页 |
| 第二章 作用于谷氨酸棒杆菌基因组实现基因敲除和过表达的遗传方法 | 第28-43页 |
| 2.1 引言 | 第28页 |
| 2.2 材料与方法 | 第28-37页 |
| 2.2.1 菌株、菌株培养条件、质粒和引物 | 第28-29页 |
| 2.2.2 培养基配制及用途 | 第29-31页 |
| 2.2.3 主要仪器和试剂 | 第31页 |
| 2.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第31-32页 |
| 2.2.5 大肠杆菌化学转化法 | 第32页 |
| 2.2.6 谷氨酸棒杆菌感受态细胞的制备 | 第32页 |
| 2.2.7 谷氨酸棒杆菌电转化法 | 第32-33页 |
| 2.2.8 基因组 DNA 提取 | 第33页 |
| 2.2.9 质粒提取 | 第33页 |
| 2.2.10 PCR 产物纯化 | 第33页 |
| 2.2.11 DNA 胶回收 | 第33页 |
| 2.2.12 PCR 反应 | 第33-34页 |
| 2.2.13 酶切反应 | 第34页 |
| 2.2.14 去磷酸化反应 | 第34页 |
| 2.2.15 酶连反应 | 第34页 |
| 2.2.16 琼脂糖凝胶电泳 | 第34页 |
| 2.2.17 谷氨酸棒杆菌粗酶液的制备 | 第34页 |
| 2.2.18 可活动性质粒 pK18mobsacB- A::B 的构建 | 第34页 |
| 2.2.19 谷氨酸棒杆菌双交换同源重组策略 | 第34页 |
| 2.2.20 目的重组谷氨酸棒杆菌菌株的构建 | 第34-36页 |
| 2.2.21 摇瓶发酵方法 | 第36页 |
| 2.2.22 分析方法 | 第36-37页 |
| 2.3 结果与分析 | 第37-41页 |
| 2.3.1 目的重组质粒 pK18mobsacB- A::B 的构建 | 第37-38页 |
| 2.3.2 目的重组菌株 C. glutamicum A::B 的构建 | 第38-39页 |
| 2.3.3 重组菌株比酶活力的测定 | 第39页 |
| 2.3.4 重组菌株菌体生长情况 | 第39-40页 |
| 2.3.5 重组菌株 L-赖氨酸积累 | 第40-41页 |
| 2.4 讨论 | 第41-42页 |
| 2.5 本章小结 | 第42-43页 |
| 第三章 分析外源果糖-1,6-二磷酸酶和果糖激酶对 L-赖氨酸合成的影响 | 第43-56页 |
| 3.1 引言 | 第43-44页 |
| 3.2 材料与方法 | 第44-48页 |
| 3.2.1 菌株、菌株培养条件、质粒和引物 | 第44页 |
| 3.2.2 培养基配制及用途 | 第44页 |
| 3.2.3 主要仪器和试剂 | 第44-45页 |
| 3.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第45页 |
| 3.2.5 大肠杆菌化学转化法 | 第45页 |
| 3.2.6 谷氨酸棒杆菌感受态细胞的制备 | 第45页 |
| 3.2.7 谷氨酸棒杆菌电转化法 | 第45页 |
| 3.2.8 基因组 DNA 提取 | 第45页 |
| 3.2.9 质粒提取 | 第45页 |
| 3.2.10 PCR 产物纯化 | 第45页 |
| 3.2.11 DNA 胶回收 | 第45页 |
| 3.2.12 PCR 反应 | 第45页 |
| 3.2.13 酶切反应 | 第45-46页 |
| 3.2.14 酶连反应 | 第46页 |
| 3.2.15 琼脂糖凝胶电泳 | 第46页 |
| 3.2.16 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） | 第46页 |
| 3.2.17 重组质粒的构建 | 第46页 |
| 3.2.18 谷氨酸棒杆菌重组菌株的构建 | 第46页 |
| 3.2.19 谷氨酸棒杆菌粗酶液的制备 | 第46页 |
| 3.2.20 摇瓶发酵方法 | 第46-47页 |
| 3.2.21 分析方法 | 第47-48页 |
| 3.3 结果与分析 | 第48-53页 |
| 3.3.1 重组质粒的确定和重组菌株的筛选 | 第48-49页 |
| 3.3.2 重组质粒在谷氨酸棒杆菌中诱导表达 | 第49页 |
| 3.3.3 重组菌株的酶活力测定 | 第49-50页 |
| 3.3.4 FBPase 酶活力的调节作用 | 第50页 |
| 3.3.5 发酵前后总糖、葡萄糖、果糖和蔗糖浓度的变化 | 第50-51页 |
| 3.3.6 不同重组菌株菌体生长情况 | 第51-52页 |
| 3.3.7 不同重组菌株合成 L-赖氨酸能力 | 第52-53页 |
| 3.3.8 不同重组菌株副产物的积累 | 第53页 |
| 3.4 讨论 | 第53-54页 |
| 3.5 本章小结 | 第54-56页 |
| 第四章 改变 L-赖氨酸前体物和 NADPH 供应对 L-赖氨酸合成的影响 | 第56-75页 |
| 4.1 引言 | 第56-58页 |
| 4.2 材料与方法 | 第58-65页 |
| 4.2.1 菌株、菌株培养条件、质粒和引物 | 第58页 |
| 4.2.2 培养基配制及用途 | 第58页 |
| 4.2.3 主要仪器和试剂 | 第58页 |
| 4.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第58页 |
| 4.2.5 大肠杆菌化学转化法 | 第58页 |
| 4.2.6 谷氨酸棒杆菌感受态细胞的制备 | 第58页 |
| 4.2.7 谷氨酸棒杆菌电转化法 | 第58页 |
| 4.2.8 基因组 DNA 提取 | 第58页 |
| 4.2.9 质粒提取 | 第58页 |
| 4.2.10 PCR 产物纯化 | 第58-59页 |
| 4.2.11 DNA 胶回收 | 第59-62页 |
| 4.2.12 PCR 反应 | 第62页 |
| 4.2.13 酶切反应 | 第62页 |
| 4.2.14 酶连反应 | 第62页 |
| 4.2.15 琼脂糖凝胶电泳 | 第62页 |
| 4.2.16 RNA 抽提 | 第62页 |
| 4.2.17 定量 PCR（RT-PCR） | 第62-63页 |
| 4.2.18 定点突变 | 第63页 |
| 4.2.19 重叠 PCR 扩增 alaT、 avtA、 aceE、 mdh 和 ilvNc | 第63页 |
| 4.2.20 重组质粒的构建 | 第63-64页 |
| 4.2.21 谷氨酸棒杆菌重组菌株的构建 | 第64页 |
| 4.2.22 谷氨酸棒杆菌粗酶液的制备 | 第64页 |
| 4.2.23 发酵法生产 L-赖氨酸 | 第64-65页 |
| 4.2.24 分析方法 | 第65页 |
| 4.3 结果与分析 | 第65-72页 |
| 4.3.1 敲除 aceE 和定点突变 pyc 增加 OAA 和丙酮酸供应 | 第65-67页 |
| 4.3.2 敲除 alaT 和 avtA 阻断 L-丙氨酸合成增加 L-赖氨酸积累 | 第67-69页 |
| 4.3.3 敲除 ldhA 和 mdh 降低乳酸和琥珀酸的合成 | 第69页 |
| 4.3.4 异源表达 pntAB 降低 NADH 含量提高 L-赖氨酸产量 | 第69页 |
| 4.3.5 降低 icd 表达量不利于 L-赖氨酸积累 | 第69-70页 |
| 4.3.6 替换 GADPH 提高葡萄糖代谢速率和 L-赖氨酸积累 | 第70-71页 |
| 4.3.7 降低 AHAS 和 HSD 酶活力增加 L-赖氨酸产量 | 第71-72页 |
| 4.4 讨论 | 第72-73页 |
| 4.5 本章小结 | 第73-75页 |
| 第五章 遗传改造 L-赖氨酸终端生物合成途径对 L-赖氨酸合成的影响 | 第75-90页 |
| 5.1 引言 | 第75-76页 |
| 5.2 材料与方法 | 第76-82页 |
| 5.2.1 菌株、菌株培养条件、质粒和引物 | 第76页 |
| 5.2.2 培养基配制及用途 | 第76页 |
| 5.2.3 主要仪器和试剂 | 第76页 |
| 5.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第76页 |
| 5.2.5 大肠杆菌化学转化法 | 第76页 |
| 5.2.6 谷氨酸棒杆菌感受态细胞的制备 | 第76-79页 |
| 5.2.7 谷氨酸棒杆菌电转化法 | 第79页 |
| 5.2.8 基因组 DNA 提取 | 第79页 |
| 5.2.9 质粒提取 | 第79页 |
| 5.2.10 PCR 产物纯化 | 第79-80页 |
| 5.2.11 DNA 胶回收 | 第80页 |
| 5.2.12 PCR 反应 | 第80页 |
| 5.2.13 酶切反应 | 第80页 |
| 5.2.14 酶连反应 | 第80页 |
| 5.2.15 琼脂糖凝胶电泳 | 第80页 |
| 5.2.16 定点突变 | 第80-81页 |
| 5.2.17 重组质粒的构建 | 第81页 |
| 5.2.18 谷氨酸棒杆菌重组菌株的构建 | 第81页 |
| 5.2.19 谷氨酸棒杆菌粗酶液的制备 | 第81页 |
| 5.2.20 发酵法生产 L-赖氨酸 | 第81页 |
| 5.2.21 分析方法 | 第81-82页 |
| 5.3 结果与分析 | 第82-86页 |
| 5.3.1 过表达 lysCC932T和 asd 增加 L-赖氨酸产量 | 第82-84页 |
| 5.3.2 过表达 dapA 和 dapB 增加 L-赖氨酸产量 | 第84页 |
| 5.3.3 过表达 ddh 增加 L-赖氨酸产量 | 第84页 |
| 5.3.4 过表达 lysA 增加 L-赖氨酸产量 | 第84-85页 |
| 5.3.5 降低 MurE 连接酶酶活力不利于 L-赖氨酸生产 | 第85页 |
| 5.3.6 异源表达 scrK 增加 L-赖氨酸产量 | 第85-86页 |
| 5.3.7 C. glutamicum Lys5-10 在 7 L 发酵罐中 L-赖氨酸产量 | 第86页 |
| 5.4 讨论 | 第86-88页 |
| 5.5 本章小结 | 第88-90页 |
| 第六章 L-赖氨酸工程菌 C. glutamicum Lys5-10 最优发酵条件的确定 | 第90-103页 |
| 6.1 引言 | 第90页 |
| 6.2 材料与方法 | 第90-92页 |
| 6.2.1 菌株、菌株培养条件 | 第90-91页 |
| 6.2.2 培养基配制及用途 | 第91页 |
| 6.2.3 主要仪器和试剂 | 第91页 |
| 6.2.4 发酵法生产 L-赖氨酸 | 第91页 |
| 6.2.5 分析方法 | 第91页 |
| 6.2.6 实验设计和数据分析 | 第91-92页 |
| 6.3 结果与分析 | 第92-101页 |
| 6.3.1 Plackett-Burman（PB）法实验 | 第92-94页 |
| 6.3.2 中心组成设计及响应面方法优化培养基组成 | 第94-96页 |
| 6.3.3 中心组成设计及响应面方法优化发酵工艺参数 | 第96-101页 |
| 6.3.4 7 L 发酵罐实验 | 第101页 |
| 6.4 讨论 | 第101-102页 |
| 6.5 本章小结 | 第102-103页 |
| 结论与展望 | 第103-105页 |
| 研究结论 | 第103-104页 |
| 课题展望 | 第104-105页 |
| 论文主要创新点 | 第105-106页 |
| 致谢 | 第106-107页 |
| 参考文献 | 第107-120页 |
| 附录：缩写中文名对照 | 第120-121页 |
| 作者简介 | 第121页 |
