| 中文摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 第一章 前言 | 第13-24页 |
| 1.1 引言 | 第13页 |
| 1.2 HA结构特征及理化性质 | 第13-15页 |
| 1.2.1 HA结构及物理性质 | 第13-14页 |
| 1.2.2 HA化学性质 | 第14-15页 |
| 1.3 HA应用 | 第15-16页 |
| 1.4 HA市场调查及前景发展 | 第16-17页 |
| 1.5 HA生产 | 第17-18页 |
| 1.5.1 自然界中HA在各物种分布情况 | 第17页 |
| 1.5.2 动物组织提取法生产HA | 第17页 |
| 1.5.3 微生物发酵法生产HA | 第17-18页 |
| 1.6 HA合成途径 | 第18-19页 |
| 1.6.1 HAS分类及特点 | 第18-19页 |
| 1.6.2 链球菌属分类及其特点 | 第19页 |
| 1.7 枯草芽孢杆菌介绍及特点 | 第19-21页 |
| 1.7.1 芽孢杆菌及枯草芽孢杆菌 | 第19-20页 |
| 1.7.2 枯草芽孢杆菌基因工程和表达系统 | 第20-21页 |
| 1.8 合成生物学 | 第21-22页 |
| 1.9 立题意义及研究内容 | 第22-24页 |
| 1.9.1 立题意义 | 第22页 |
| 1.9.2 研究内容 | 第22-24页 |
| 第二章 HAS基因克隆及HA合成通路构建 | 第24-47页 |
| 2.1 引言 | 第24页 |
| 2.2 实验材料 | 第24-28页 |
| 2.2.1 菌种和质粒 | 第24页 |
| 2.2.2 培养基及配制溶液 | 第24-26页 |
| 2.2.3 主要实验试剂 | 第26-27页 |
| 2.2.4 实验仪器 | 第27-28页 |
| 2.3 大肠杆菌重组质粒PUC-HAS构建 | 第28-35页 |
| 2.3.1 HAS模板基因选择 | 第28页 |
| 2.3.2 引物设计及质粒选择 | 第28-29页 |
| 2.3.3 酿脓链球菌活化及培养 | 第29-30页 |
| 2.3.4 酿脓链球菌基因组DNA提取 | 第30-31页 |
| 2.3.5 目的基因HAS的PCR扩增 | 第31-32页 |
| 2.3.6 PCR产物胶回收 | 第32-33页 |
| 2.3.7 限制性内切酶消化 | 第33页 |
| 2.3.8 目的片段与载体的连接 | 第33-34页 |
| 2.3.9 大肠杆菌感受态的制作 | 第34页 |
| 2.3.10 重组质粒转化DH5α | 第34页 |
| 2.3.11 菌落PCR检测阳性克隆 | 第34-35页 |
| 2.4 枯草芽孢杆菌重组质粒的构建 | 第35-39页 |
| 2.4.1 枯草芽孢杆菌感受态制备 | 第35页 |
| 2.4.2 以PUC-HAS重组质粒为模板二次获得HAS基因序列 | 第35-36页 |
| 2.4.3 目的基因片段与质粒双酶切 | 第36页 |
| 2.4.4 连接及转化 | 第36页 |
| 2.4.5 枯草芽孢杆菌菌落PCR筛选阳性克隆 | 第36页 |
| 2.4.6 pNCMO2-HAS质粒提取 | 第36-37页 |
| 2.4.7 pNMCO2-HAS重组质粒双酶切验证 | 第37-38页 |
| 2.4.8 SDS-PAGE检测HAS表达量 | 第38-39页 |
| 2.5 实验结果 | 第39-45页 |
| 2.5.1 酿脓链球菌基因组DNA提取 | 第39-40页 |
| 2.5.2 温度梯度PCR扩增HAS基因片段 | 第40-41页 |
| 2.5.3 pUC119质粒及HAS基因片段双酶切电泳检测 | 第41页 |
| 2.5.4 含pUC-HAS重组质粒大肠杆菌菌落PCR产物电泳检测 | 第41-42页 |
| 2.5.5 对pUC-HAS重组质粒测序及比对 | 第42-43页 |
| 2.5.6 pNCM02-HAS重组质粒转化枯草芽孢杆菌菌落PCR检测 | 第43页 |
| 2.5.7 pNCM02-HAS重组质粒转化枯草芽孢杆菌双酶切检测 | 第43-44页 |
| 2.5.8 对pNCM02-HAS重组质粒测序及比对 | 第44页 |
| 2.5.9 SDS-PAGE蛋白电泳检测HAS表达 | 第44-45页 |
| 2.6 本章小结 | 第45-47页 |
| 第三章 新代谢通路合成HA产量测定 | 第47-58页 |
| 3.1 引言 | 第47页 |
| 3.2 材料与方法 | 第47-48页 |
| 3.2.1 实验试剂 | 第47页 |
| 3.2.2 实验仪器 | 第47-48页 |
| 3.3 实验方法 | 第48页 |
| 3.4 CTAB法检测发酵液中HA优化 | 第48-51页 |
| 3.4.1 HA与CTAB反应溶液的光谱学特性 | 第48-49页 |
| 3.4.2 基于不同波长对HA-CTAB反应溶液制作标准曲线的影响 | 第49页 |
| 3.4.3 基于不同CTAB浓度对反应体系稳定性影响 | 第49页 |
| 3.4.4 基于不同温度对反应体系稳定性影响 | 第49-50页 |
| 3.4.5 基于不同反应时间对反应体系稳定性影响 | 第50页 |
| 3.4.6 基于不同杂质对CTAB-HA测定结果的影响 | 第50-51页 |
| 3.5 反应条件优化小结 | 第51-53页 |
| 3.6 培养液中HA按量测定及HA性质初测 | 第53-55页 |
| 3.6.1 培养液中HA含量测定 | 第53页 |
| 3.6.2 HA性质初测 | 第53-55页 |
| 3.7 HA分离纯化 | 第55-56页 |
| 3.7.1 背景介绍： | 第55页 |
| 3.7.2 操作方法 | 第55页 |
| 3.7.3 HA得率及蛋白除去率 | 第55-56页 |
| 3.8 本章小结 | 第56-58页 |
| 第四章 HA发酵条件优化 | 第58-67页 |
| 4.1 引言 | 第58页 |
| 4.2 单因素检测不同因素对枯草芽孢杆菌发酵的影响 | 第58-59页 |
| 4.2.1 碳源种类对枯草芽孢杆菌发酵的影响 | 第58页 |
| 4.2.2 氮源种类对枯草芽孢杆菌发酵的影响 | 第58页 |
| 4.2.3 金属离子种类对枯草芽孢杆菌发酵的影响 | 第58-59页 |
| 4.2.4 培养基PH对枯草芽孢杆菌发酵的影响 | 第59页 |
| 4.2.5 培养温度对枯草芽孢杆菌发酵的影响 | 第59页 |
| 4.2.6 发酵时间对枯草芽孢杆菌发酵的影响 | 第59页 |
| 4.3 单因素分析实验小结 | 第59-63页 |
| 4.3.1 不同碳源对重组枯草芽孢杆菌发酵生产HA的影响 | 第59-60页 |
| 4.3.2 不同氮源对重组枯草芽孢杆菌发酵生产HA的影响 | 第60-61页 |
| 4.3.3 金属离子对重组枯草芽孢杆菌发酵生产HA的影响 | 第61页 |
| 4.3.4 发酵温度对重组枯草芽孢杆菌发酵生产HA的影响 | 第61-62页 |
| 4.3.5 培养基pH对重组枯草芽孢杆菌发酵生产HA的影响 | 第62-63页 |
| 4.3.6 发酵时间对重组枯草芽孢杆菌发酵生产HA的影响 | 第63页 |
| 4.4 正交设计优化培养基组分 | 第63-65页 |
| 4.5 发酵罐小试 | 第65页 |
| 4.6 本章小结 | 第65-67页 |
| 第五章 结论 | 第67-68页 |
| 参考文献 | 第68-73页 |
| 致谢 | 第73页 |
