| 摘要 | 第4-7页 |
| ABSTRACT | 第7-10页 |
| 1 文献综述 | 第16-40页 |
| 1.1 生物丁醇概述 | 第16-18页 |
| 1.2 生物法生产丁醇研究进展 | 第18-27页 |
| 1.2.1 生物丁醇生产菌种及改良 | 第18-21页 |
| 1.2.2 丁醇的生物合成途径及代谢调控 | 第21-22页 |
| 1.2.3 生物丁醇发酵原料 | 第22-23页 |
| 1.2.4 丁醇耐受性 | 第23-25页 |
| 1.2.5 木质纤维素原料发酵产丁醇 | 第25-27页 |
| 1.3 基因组改组(Genome shuffling)育种 | 第27-33页 |
| 1.3.1 基因组改组技术 | 第27-30页 |
| 1.3.2 基因组改组育种研究进展 | 第30-33页 |
| 1.4 进化工程育种 | 第33-36页 |
| 1.4.1 进化工程的原理与方法 | 第33-34页 |
| 1.4.2 进化工程育种研究进展 | 第34-36页 |
| 1.5 立题背景与意义 | 第36-40页 |
| 1.5.1 立题背景 | 第36-37页 |
| 1.5.2 立题意义 | 第37-38页 |
| 1.5.3 主要研究内容与技术路线 | 第38-40页 |
| 2 基因组改组亲本菌株库的建立 | 第40-58页 |
| 2.1 实验材料 | 第40-42页 |
| 2.1.1 菌种 | 第40页 |
| 2.1.2 实验仪器 | 第40-41页 |
| 2.1.3 实验药品与试剂 | 第41页 |
| 2.1.4 培养基 | 第41-42页 |
| 2.1.5 培养方法 | 第42页 |
| 2.2 方法 | 第42-46页 |
| 2.2.1 紫外诱变 | 第42-43页 |
| 2.2.2 核糖体工程育种 | 第43-44页 |
| 2.2.3 丁醇耐受性筛选 | 第44页 |
| 2.2.4 遗传稳定性 | 第44-45页 |
| 2.2.5 分析方法 | 第45-46页 |
| 2.2.5.1 还原糖含量测定 | 第45页 |
| 2.2.5.2 乙酸、丁酸含量测定 | 第45页 |
| 2.2.5.3 ABE含量的测定 | 第45-46页 |
| 2.3 实验结果与分析 | 第46-56页 |
| 2.3.1 紫外诱变结果 | 第46-49页 |
| 2.3.1.1 第一轮紫外诱变结果 | 第46页 |
| 2.3.1.2 第二轮紫外诱变结果 | 第46-48页 |
| 2.3.1.3 第三轮诱变结果 | 第48-49页 |
| 2.3.2 核糖体工程育种结果 | 第49-50页 |
| 2.3.3 高丁醇耐受性菌株筛选结果 | 第50-52页 |
| 2.3.4 突变株遗传稳定性分析 | 第52-56页 |
| 2.4 本章小结 | 第56-58页 |
| 3 基因组改组选育高产丁醇重组菌 | 第58-81页 |
| 3.1 实验材料 | 第58-59页 |
| 3.1.1 菌种 | 第58页 |
| 3.1.2 实验仪器 | 第58页 |
| 3.1.3 实验试剂 | 第58-59页 |
| 3.1.4 培养基及溶液 | 第59页 |
| 3.2 实验方法 | 第59-62页 |
| 3.2.1 原生质体的制备 | 第59-60页 |
| 3.2.2 原生质体的再生与融合 | 第60页 |
| 3.2.3 基因组改组参数的计算 | 第60-61页 |
| 3.2.4 基因组改组 | 第61-62页 |
| 3.2.4.1 第一轮基因组改组 | 第61页 |
| 3.2.4.2 第二基因组改组与第三轮基因组改组 | 第61-62页 |
| 3.2.4.3 重组菌株的筛选 | 第62页 |
| 3.2.4.4 重组菌株的稳定性检验 | 第62页 |
| 3.3 实验结果与分析 | 第62-79页 |
| 3.3.1 原生质体制备的影响因素 | 第62-66页 |
| 3.3.1.1 菌体菌龄对原生质体制备的影响 | 第63-64页 |
| 3.3.1.2 酶浓度对原生质体制备影响 | 第64页 |
| 3.3.1.3 酶解温度对原生质体形成的影响 | 第64-65页 |
| 3.3.1.4 酶处理时间对原生质体形成的影响 | 第65-66页 |
| 3.3.2 中心组合实验设计优化 | 第66-68页 |
| 3.3.3 响应面模型分析 | 第68-70页 |
| 3.3.4 原生质体制备结果 | 第70-71页 |
| 3.3.5 原生质体融合条件筛选 | 第71-74页 |
| 3.3.5.1 PEG4000浓度对原生质体融合的影响 | 第71-72页 |
| 3.3.5.2 融合温度对原生质体融合的影响 | 第72页 |
| 3.3.5.3 融合时间对原生质体融合的影响 | 第72-73页 |
| 3.3.5.4 Ca~(2+)浓度对原生质体融合的影响 | 第73-74页 |
| 3.3.6 基因组改组筛选高产丁醇优良菌株 | 第74-77页 |
| 3.3.6.1 第一轮基因组改组 | 第74-75页 |
| 3.3.6.2 第二轮基因组改组 | 第75-76页 |
| 3.3.6.3 第三轮基因组改组 | 第76-77页 |
| 3.3.7 重组菌株的发酵性能稳定性检验 | 第77-79页 |
| 3.4 本章小结 | 第79-81页 |
| 4 重组菌株在高浓度杨木水解液中的进化培养研究 | 第81-95页 |
| 4.1 实验材料 | 第81-82页 |
| 4.1.1 菌种 | 第81页 |
| 4.1.2 实验仪器 | 第81页 |
| 4.1.3 实验试剂 | 第81-82页 |
| 4.1.4 培养基 | 第82页 |
| 4.2 实验方法 | 第82-84页 |
| 4.2.1 选择压力的的确定 | 第82-83页 |
| 4.2.2 菌株代时的确定 | 第83页 |
| 4.2.3 恒定杨木水解液浓度下的进化培养 | 第83-84页 |
| 4.2.4 梯度发酵底物浓度下的进化培养 | 第84页 |
| 4.2.5 进化菌株的筛选 | 第84页 |
| 4.3 实验结果与讨论 | 第84-93页 |
| 4.3.1 菌株代时的确定 | 第84-85页 |
| 4.3.2 选择压力的确定 | 第85-87页 |
| 4.3.2.1 重组菌株丁醇耐受性平板存活率筛选结果 | 第85页 |
| 4.3.2.2 不同杨木水解液浓度对丁醇发酵的影响 | 第85-87页 |
| 4.3.3 进化策略的选择 | 第87-91页 |
| 4.3.3.1 恒定底物浓度下的培养进化 | 第87-90页 |
| 4.3.3.2 梯度底物浓度下的进化培养 | 第90-91页 |
| 4.3.4 两种不同底物浓度下调控进化分析 | 第91-93页 |
| 4.3.4.1 菌株发酵过程的比较 | 第91-93页 |
| 4.4 本章小结 | 第93-95页 |
| 5 进化菌株利用杨木水解液发酵产丁醇条件优化 | 第95-114页 |
| 5.1 材料 | 第95-96页 |
| 5.1.1 菌种 | 第95-96页 |
| 5.1.2 主要实验仪器与试剂 | 第96页 |
| 5.1.3 培养基 | 第96页 |
| 5.1.4 培养方法 | 第96页 |
| 5.2 方法 | 第96-98页 |
| 5.2.1 检测方法 | 第96页 |
| 5.2.2 发酵培养基组分Plackett-Burman筛选实验 | 第96-97页 |
| 5.2.3 重要组分中心组合实验设计(CCD) | 第97-98页 |
| 5.2.4 中心组合实验设计(CCD)优化发酵条件 | 第98页 |
| 5.3 实验结果与分析 | 第98-113页 |
| 5.3.1 Plackett-Burman筛选结果 | 第98-102页 |
| 5.3.2 重要组分CCD优化结果 | 第102-107页 |
| 5.3.3 发酵条件CCD响应面优化结果 | 第107-113页 |
| 5.4 本章小结 | 第113-114页 |
| 6 进化菌株丁醇合成途径中关键基因的差异表达研究 | 第114-123页 |
| 6.1 实验材料 | 第115页 |
| 6.1.1 样品采集与处理 | 第115页 |
| 6.1.2 实验仪器与试剂 | 第115页 |
| 6.2 实验方法 | 第115-118页 |
| 6.2.1 总RNA提取 | 第115-116页 |
| 6.2.2 RNA质量检测 | 第116页 |
| 6.2.3 实时荧光定量PCR | 第116-118页 |
| 6.2.4 实验数据分析 | 第118页 |
| 6.3 实验结果分析 | 第118-122页 |
| 6.3.1 RNA样品质检结果 | 第118-119页 |
| 6.3.2 进化菌株丁醇生物合成途径中关键酶基因表达分析 | 第119-122页 |
| 6.4 本章小结 | 第122-123页 |
| 7 结论与展望 | 第123-126页 |
| 7.1 主要结论 | 第123-125页 |
| 7.2 创新点 | 第125页 |
| 7.3 展望 | 第125-126页 |
| 参考文献 | 第126-140页 |
| 附录A | 第140-142页 |
| 附录B | 第142-143页 |
| 附录C (攻读学位期间的主要学术成果) | 第143-144页 |
| 致谢 | 第144页 |
