| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 第一章 文献综述 | 第13-30页 |
| 1.1 基因组编辑 | 第13-14页 |
| 1.2 人工核酸内切酶 | 第14-23页 |
| 1.2.1 锌指核酸酶 | 第15-16页 |
| 1.2.2 类转录激活因子核酸酶 | 第16-18页 |
| 1.2.3 CRISPR/Cas9核酸酶 | 第18-23页 |
| 1.3 CRISPR/Cas9介导的定点修饰技术在动物中的应用 | 第23-29页 |
| 1.3.1 CRISPR/Cas9技术在畜禽生产性能改良上的应用 | 第24-26页 |
| 1.3.2 CRISPR/Cas9技术在畜禽功能基因上的应用 | 第26-27页 |
| 1.3.3 CRISPR/Cas9技术在畜禽用疾病模型和生物医学上的应用 | 第27-29页 |
| 1.4 本研究的目的意义 | 第29-30页 |
| 第二章 Rep/Don打靶系统的构建 | 第30-48页 |
| 2.1 试验材料 | 第31-33页 |
| 2.1.1 菌株、细胞系及质粒 | 第31-32页 |
| 2.1.2 试剂 | 第32页 |
| 2.1.3 试剂配制 | 第32页 |
| 2.1.4 主要仪器设备 | 第32页 |
| 2.1.5 引物 | 第32-33页 |
| 2.2 试验方法 | 第33-40页 |
| 2.2.1 Rep/Don PG载体构建 | 第33页 |
| 2.2.2 CCR5靶位点Rep/Don PG载体的构建 | 第33-36页 |
| 2.2.3 Rep/Don NR载体构建 | 第36-39页 |
| 2.2.4 CRISPR/Cas9表达载体的构建 | 第39页 |
| 2.2.5 细胞培养 | 第39-40页 |
| 2.2.6 细胞转染 | 第40页 |
| 2.3 试验结果 | 第40-46页 |
| 2.3.1 Rep/Don载体系统的构建 | 第40-42页 |
| 2.3.2 Rep/Don NR载体 | 第42-44页 |
| 2.3.3 CRISPR/Cas9核酸酶活性验证 | 第44-45页 |
| 2.3.4 Rep/Don PG和Rep/DonNR载体系统工作验证 | 第45-46页 |
| 2.4 讨论 | 第46-47页 |
| 2.5 小结 | 第47-48页 |
| 第三章 Rep/Don打靶系统的优化及其在HEK293细胞上的应用 | 第48-76页 |
| 3.1 试验材料 | 第49-50页 |
| 3.1.1 菌株、细胞及质粒 | 第49页 |
| 3.1.2 试剂 | 第49页 |
| 3.1.3 试剂配制 | 第49页 |
| 3.1.4 主要仪器设备 | 第49-50页 |
| 3.1.5 引物 | 第50页 |
| 3.2 试验方法 | 第50-56页 |
| 3.2.1 细胞培养 | 第50页 |
| 3.2.2 细胞转染 | 第50页 |
| 3.2.3 CCR5基因CCR5a靶位点Rep/Don PG载体的构建 | 第50-52页 |
| 3.2.4 Rep/Don ZR载体 | 第52-54页 |
| 3.2.5 嘌呤霉素筛选阳性细胞 | 第54页 |
| 3.2.6 G418筛选阳性细胞 | 第54页 |
| 3.2.7 博莱霉素用于细胞筛选 | 第54-55页 |
| 3.2.8 嘌呤霉素和博莱霉素共同筛选阳性细胞 | 第55页 |
| 3.2.9 流式细胞仪检测Rep/Don打靶系统效率 | 第55页 |
| 3.2.10 单克隆细胞基因组DNA PCR分型检测 | 第55-56页 |
| 3.3 试验结果 | 第56-72页 |
| 3.3.1 Rep/Don系统在HEK293A细胞基因组CCR5基因位点的敲入 | 第56-57页 |
| 3.3.2 细胞克隆基因组DNA的PCR分型检测 | 第57-59页 |
| 3.3.3 测序检测细胞基因组DNA CCR5基因靶位点 | 第59页 |
| 3.3.4 pXL-CCR5a 515382 \h l载体的构建 | 第59-61页 |
| 3.3.5 Rep/Don ZR载体系统的构建 | 第61-63页 |
| 3.3.6 CCR5a.Rep/Don PG载体的构建 | 第63-64页 |
| 3.3.7 CCR5a.Rep/Don PG和CCR5a.Rep/DonZR载体系统工作验证 | 第64-65页 |
| 3.3.8 CRISPR/Cas9打靶后SSA的修复效率 | 第65-66页 |
| 3.3.9 用于HEK293T细胞筛选的博莱霉素最佳浓度 | 第66-67页 |
| 3.3.10 嘌呤霉素和博莱霉素筛选细胞 | 第67-68页 |
| 3.3.11 Rep/Don打靶系统在哺乳动物细胞基因组水平工作效率的检测 | 第68-72页 |
| 3.4 讨论 | 第72-74页 |
| 3.5 小结 | 第74-76页 |
| 第四章 Rep/Don打靶系统靶向编辑猪lnc-sscg3623基因 | 第76-116页 |
| 4.1 试验材料 | 第76-78页 |
| 4.1.1 菌株、细胞系及质粒 | 第76-77页 |
| 4.1.2 试剂 | 第77页 |
| 4.1.3 试剂配制 | 第77页 |
| 4.1.4 主要仪器设备 | 第77页 |
| 4.1.5 引物 | 第77-78页 |
| 4.2 实验方法 | 第78-86页 |
| 4.2.1 lnc-sscg3623基因CRISPR/Cas9核酸酶靶位点的选择 | 第78-79页 |
| 4.2.2 lnc-sscg3623基因RPG载体的构建 | 第79页 |
| 4.2.3 CRISPR/Cas9表达载体的构建 | 第79-80页 |
| 4.2.4 lnc-sscg3623基因靶位点Rep/Don PG载体的构建 | 第80-81页 |
| 4.2.5 lnc-sscg3623基因靶位点Rep/Don NR载体的构建 | 第81-82页 |
| 4.2.6 lnc-sscg3623基因靶位点Rep/Don ZR载体的构建 | 第82页 |
| 4.2.7 细胞培养 | 第82页 |
| 4.2.8 细胞转染 | 第82-83页 |
| 4.2.9 嘌呤霉素筛选细胞 | 第83-84页 |
| 4.2.10 G418筛选细胞 | 第84页 |
| 4.2.11 博莱霉素用于细胞筛选 | 第84页 |
| 4.2.12 两种抗生素药物同时筛选细胞 | 第84-85页 |
| 4.2.13 细胞基因组提取及PCR扩增鉴定 | 第85-86页 |
| 4.3 试验结果 | 第86-113页 |
| 4.3.1 lnc-sscg3623基因RPG载体的构建 | 第86页 |
| 4.3.2 lnc-sscg3623基因的CRISPR/Cas9表达载体构建 | 第86-87页 |
| 4.3.3 lnc-sscg3623基因三个靶位点效率的检测 | 第87-88页 |
| 4.3.4 lnc-sscg3623基因两靶位点串连的报告载体和Csa9表达载体的构建 | 第88-90页 |
| 4.3.5 一个靶位点与两个靶位点串连的效率比较 | 第90-91页 |
| 4.3.6 lnc-sscg3623基因靶位点Rep/Don PG载体的构建 | 第91-95页 |
| 4.3.7 lnc-sscg3623基因靶位点Rep/Don NR载体的构建 | 第95-98页 |
| 4.3.8 lnc-sscg3623基因靶位点Rep/Don ZR载体的构建 | 第98-100页 |
| 4.3.9 嘌呤霉素作用于PK15细胞的最佳浓度 | 第100-101页 |
| 4.3.10 G418最佳工作浓度的确定 | 第101-102页 |
| 4.3.11 博莱霉素最佳工作浓度的确定 | 第102-103页 |
| 4.3.12 三种抗生素筛选细胞 | 第103-105页 |
| 4.3.13 Rep/Don打靶系统在lnc-sscg3623基因Tar1基因组水平工作效率检测 | 第105-108页 |
| 4.3.14 Rep/Don打靶系统在lnc-sscg3623基因Tar2基因组水平工作效率的检测 | 第108-113页 |
| 4.4 讨论 | 第113-114页 |
| 4.5 小结 | 第114-116页 |
| 结论与创新点 | 第116-117页 |
| 参考文献 | 第117-129页 |
| 缩略词 | 第129-130页 |
| 致谢 | 第130-131页 |
| 作者简介 | 第131页 |
