| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-7页 |
| 第一章 引言 | 第11-20页 |
| 1.常见食源性致病菌CRISPR系统结构与功能研究进展 | 第11-16页 |
| 1.1 CRISPR系统的基本结构与作用机制 | 第11-12页 |
| 1.2 革兰氏阴性菌中CRISPR系统结构与功能 | 第12-14页 |
| 1.2.1 I-E型CRISPR系统 | 第12-13页 |
| 1.2.2 I-F型CRISPR系统 | 第13-14页 |
| 1.3 革兰氏阳性菌中CRISPR系统结构与功能 | 第14-15页 |
| 1.3.1 I-B型CRISPR系统 | 第14页 |
| 1.3.2 RliB CRISPR系统 | 第14-15页 |
| 1.3.3 II-A型CRISPR系统 | 第15页 |
| 1.4 小结 | 第15-16页 |
| 2. CRISPR/Cas9基因编辑技术研究进展 | 第16-18页 |
| 2.1 CRISPR/Cas9技术原理 | 第16-17页 |
| 2.2 技术优势 | 第17页 |
| 2.3 细菌中的相关应用 | 第17页 |
| 2.4 技术缺陷 | 第17-18页 |
| 3.展望 | 第18-20页 |
| 3.1 食源性致病菌分型溯源与风险评估 | 第18页 |
| 3.2 控制耐药与毒力基因在食源性致病菌间的扩散 | 第18-19页 |
| 3.3 深入探究食源性致病菌致病机制 | 第19-20页 |
| 第二章 副溶血性弧菌CRISPR的检测及其结构分析 | 第20-29页 |
| 1. 前言 | 第20页 |
| 2. 材料和方法 | 第20-22页 |
| 2.1 菌株 | 第20-21页 |
| 2.2 菌种活化 | 第21页 |
| 2.3 基因组DNA提取 | 第21-22页 |
| 2.4 CRISPR检测 | 第22页 |
| 3. 结果与分析 | 第22-27页 |
| 3.1 79株VP CRISPR位点分析 | 第22-25页 |
| 3.1.1 CRISPR的检测结果 | 第22-23页 |
| 3.1.2 CRISPR的重复序列 | 第23-24页 |
| 3.1.3 CRISPR的间隔序列 | 第24-25页 |
| 3.2 不同来源的VP间CRISPR位点的比较分析 | 第25-27页 |
| 3.2.1 环境菌株与临床菌株CRISPR位点的比较分析 | 第25-26页 |
| 3.2.2 79株VP与数据库中全基因组测序的VP的CRISPR位点的比较分析 | 第26-27页 |
| 4. 讨论 | 第27-28页 |
| 5. 本章小结 | 第28-29页 |
| 第三章 CRISPR/Cas9基因编辑技术在大肠杆菌中的应用研究 | 第29-39页 |
| 1. 前言 | 第29页 |
| 2. 材料与方法 | 第29-34页 |
| 2.1 菌株与质粒 | 第29-30页 |
| 2.2 试剂与培养基 | 第30页 |
| 2.3 引物 | 第30-31页 |
| 2.4 qseB基因打靶片段的构建 | 第31-32页 |
| 2.4.1 qseB基因上下游同源片段的扩增与回收 | 第31页 |
| 2.4.2 上下游融合片段的扩增与测序 | 第31-32页 |
| 2.5 pTarget F-sgRNA载体的构建 | 第32-33页 |
| 2.5.1 sgRNA的设计及磷酸化修饰 | 第32页 |
| 2.5.2 pTarget F-sgRNA载体的扩增 | 第32页 |
| 2.5.3 酶切 | 第32-33页 |
| 2.5.4 连接 | 第33页 |
| 2.5.5 转化 | 第33页 |
| 2.5.6 筛选阳性克隆 | 第33页 |
| 2.6 制备E.coli MG1655电转化感受态细胞 | 第33页 |
| 2.7 电转化pCas质粒 | 第33-34页 |
| 2.8 制备含pCas质粒的电转化感受态细胞 | 第34页 |
| 2.9 qseB基因缺失株的构建 | 第34页 |
| 2.9.1 共转化 | 第34页 |
| 2.9.2 质粒消除 | 第34页 |
| 3. 实验结果 | 第34-37页 |
| 3.1 基因敲除打靶片段扩增 | 第34-35页 |
| 3.2 pTarget F-ΔqseB质粒构建 | 第35页 |
| 3.3 缺失突变株的鉴定 | 第35-37页 |
| 4. 讨论 | 第37页 |
| 5. 本章小结 | 第37-39页 |
| 第四章 CRISPR/Cas9基因编辑技术在副溶血性弧菌中的应用研究 | 第39-50页 |
| 1. 前言 | 第39-40页 |
| 2. 材料与方法 | 第40-45页 |
| 2.1 菌株与质粒 | 第40页 |
| 2.2 试剂与培养基 | 第40页 |
| 2.3 引物 | 第40-41页 |
| 2.4 aphA、opaR基因打靶片段的构建 | 第41-42页 |
| 2.4.1 aphA、opaR基因上下游同源片段的扩增与回收 | 第41页 |
| 2.4.2 aphA、opaR基因上下游融合片段的扩增与测序 | 第41-42页 |
| 2.5 pTarget F-sgRNA载体的构建 | 第42-43页 |
| 2.5.1 sgRNA的设计及磷酸化修饰 | 第42页 |
| 2.5.2 pTarget F-sgRNA载体的扩增 | 第42页 |
| 2.5.3 酶切 | 第42页 |
| 2.5.4 连接 | 第42页 |
| 2.5.5 转化 | 第42-43页 |
| 2.5.6 筛选阳性克隆 | 第43页 |
| 2.6 一步法制备含有打靶基因同源臂的pTargetT-ΔaphA、pTargetT-ΔopaR质粒 | 第43-44页 |
| 2.6.1 PCR扩增所需片段 | 第43页 |
| 2.6.2 pTarget载体双酶切 | 第43页 |
| 2.6.3 连接 | 第43页 |
| 2.6.4 转化 | 第43-44页 |
| 2.6.5 筛选转化子 | 第44页 |
| 2.7 制备VP31电转化感受态细胞 | 第44页 |
| 2.8 电转化pCas质粒 | 第44页 |
| 2.9 制备含pCas质粒的电转化感受态细胞及共转化 | 第44-45页 |
| 3. 实验结果 | 第45-47页 |
| 3.1 基因敲除打靶片段扩增 | 第45页 |
| 3.2 pTarget-sgRNA载体的构建 | 第45-46页 |
| 3.3 质粒转化 | 第46-47页 |
| 4.讨论 | 第47-48页 |
| 5. 本章总结 | 第48-50页 |
| 全文总结 | 第50-51页 |
| 参考文献 | 第51-56页 |
| 附录 | 第56-57页 |
| 攻读硕士学位期间取得的科研成果 | 第57-58页 |
| 致谢 | 第58页 |
