| 摘要 | 第6-8页 |
| ABSTRACT | 第8-9页 |
| 文献综述 | 第13-28页 |
| 第一章 轮状病毒及其NSP4及其viroporin研究进展 | 第13-28页 |
| 1.1 轮状病毒的结构及生物学特性 | 第14-16页 |
| 1.1.1 轮状病毒的结构 | 第14页 |
| 1.1.2 轮状病毒的分类 | 第14-15页 |
| 1.1.3 轮状病毒的流行病学 | 第15页 |
| 1.1.4 轮状病毒的致病机制 | 第15-16页 |
| 1.2 NSP4的结构及特征 | 第16-17页 |
| 1.2.1 NSP4基因 | 第16页 |
| 1.2.2 NSP4蛋白的结构特征 | 第16-17页 |
| 1.3 NSP4的多功能性 | 第17-20页 |
| 1.3.1 NSP4具有细胞内受体的功能 | 第17-18页 |
| 1.3.2 NSP4的致腹泻作用 | 第18页 |
| 1.3.3 NSP4与免疫 | 第18-19页 |
| 1.3.4 NSP4与种间重组 | 第19-20页 |
| 1.4 viroporin的结构与特征 | 第20-22页 |
| 1.4.1 viroporin的结构 | 第20-21页 |
| 1.4.2 viroporin的分类 | 第21-22页 |
| 1.5 viroporin的功能 | 第22-23页 |
| 1.5.1 膜通透性 | 第22页 |
| 1.5.2 viroporin与病毒生命周期 | 第22-23页 |
| 1.5.3 viroporin的孔形成活性 | 第23页 |
| 1.6 NSP4 viroporin致细胞凋亡的研究进展 | 第23-24页 |
| 1.7 内质网应激与细胞凋亡 | 第24-28页 |
| 1.7.1 内质网应激概述 | 第24-25页 |
| 1.7.2 依赖UPR的ERS诱导的细胞凋亡 | 第25-26页 |
| 1.7.3 不依赖UPR的ERS诱导的细胞凋亡 | 第26-28页 |
| 试验研究 | 第28-54页 |
| 第二章 真核表达质粒pcDNA3.1-NSP4-Flag和pcDNA3.1-viroporin-Flag的构建 | 第28-38页 |
| 2.1 材料 | 第28-29页 |
| 2.1.1 细胞、病毒、载体和菌株 | 第28-29页 |
| 2.1.2 主要试剂 | 第29页 |
| 2.1.3 主要仪器设备 | 第29页 |
| 2.1.4 试剂的配制 | 第29页 |
| 2.2 方法 | 第29-32页 |
| 2.2.1 细胞的培养 | 第29页 |
| 2.2.2 病毒增殖和感染 | 第29页 |
| 2.2.3 病毒总RNA的提取 | 第29页 |
| 2.2.4 引物的设计与合成 | 第29-30页 |
| 2.2.5 目的基因的PCR扩增 | 第30页 |
| 2.2.6 目的基因片段与载体的双酶切 | 第30-31页 |
| 2.2.7 目的基因片段的克隆 | 第31-32页 |
| 2.2.8 重组质粒的鉴定 | 第32页 |
| 2.3 结果 | 第32-36页 |
| 2.3.1 PoRV NSP4及其viroporin基因的PCR扩增及鉴定 | 第32-34页 |
| 2.3.2 重组质粒的PCR鉴定结果 | 第34页 |
| 2.3.3 重组质粒的双酶切鉴定结果 | 第34-35页 |
| 2.3.4 重组质粒的测序结果 | 第35-36页 |
| 2.4 讨论 | 第36-37页 |
| 2.5 小结 | 第37-38页 |
| 第三章 猪轮状病毒NSP4及其viroporin诱导细胞凋亡 | 第38-48页 |
| 3.1 材料 | 第38-39页 |
| 3.1.1 细胞和质粒 | 第38页 |
| 3.1.2 主要试剂 | 第38页 |
| 3.1.3 主要仪器设备 | 第38-39页 |
| 3.2 方法 | 第39-41页 |
| 3.2.1 细胞培养 | 第39页 |
| 3.2.2 重组质粒转染细胞 | 第39页 |
| 3.2.3 WST法测细胞增殖 | 第39页 |
| 3.2.4 DNA Ladder试验 | 第39页 |
| 3.2.5 RNA提取及cDNA的合成 | 第39页 |
| 3.2.6 实时荧光定量PCR | 第39-40页 |
| 3.2.7 蛋白样品的处理 | 第40-41页 |
| 3.2.8 Western blot分析 | 第41页 |
| 3.3 结果 | 第41-45页 |
| 3.3.1 重组质粒转染细胞的效果 | 第41-42页 |
| 3.3.2 重组质粒在细胞内的蛋白表达检测 | 第42页 |
| 3.3.3 重组质粒对细胞的增殖活性检测结果 | 第42-43页 |
| 3.3.4 DNA Ladder分析 | 第43页 |
| 3.3.5 NSP4及其viroporin对凋亡因子caspase-3、8、9 蛋白水平的影响 | 第43-44页 |
| 3.3.6 NSP4及其viroporin对凋亡因子Bax、Bcl-2、caspase-3 转录水平的影响 | 第44-45页 |
| 3.4 讨论 | 第45-46页 |
| 3.5 小结 | 第46-48页 |
| 第四章 猪轮状病毒NSP4及其viroporin诱导内质网应激介导的细胞凋亡 | 第48-54页 |
| 4.1 材料 | 第48页 |
| 4.1.1 细胞 | 第48页 |
| 4.1.2 主要试剂 | 第48页 |
| 4.2 方法 | 第48-49页 |
| 4.2.1 细胞的培养 | 第48页 |
| 4.2.2 重组质粒转染细胞 | 第48页 |
| 4.2.3 实时荧光定量PCR | 第48-49页 |
| 4.2.4 蛋白样品的处理 | 第49页 |
| 4.2.5 Western blot分析 | 第49页 |
| 4.3 结果 | 第49-52页 |
| 4.3.1 实时荧光定量PCR检测GRP78和CHOP的mRNA表达水平 | 第49-50页 |
| 4.3.2 Western blot检测GRP78、CHOP和caspase-12的蛋白表达水平 | 第50-51页 |
| 4.3.3 NSP4及其viroporin激活ATF6途径相关的ERS | 第51页 |
| 4.3.4 NSP4及其viroporin激活ATF4途径相关的ERS | 第51-52页 |
| 4.3.5 NSP4及其viroporin激活IER1α 途径相关的ERS | 第52页 |
| 4.4 讨论 | 第52-53页 |
| 4.5 小结 | 第53-54页 |
| 结论 | 第54-55页 |
| 参考文献 | 第55-66页 |
| 附录 1 | 第66-68页 |
| 致谢 | 第68-70页 |
| 作者简介 | 第70页 |
