| 摘要 | 第4-7页 |
| ABSTRACT | 第7-9页 |
| 第一章 文献综述 | 第18-30页 |
| 1.1 谷胱甘肽 | 第18页 |
| 1.2 谷胱甘肽的功能及应用 | 第18-20页 |
| 1.2.1 医药领域 | 第18-19页 |
| 1.2.2 食品领域 | 第19-20页 |
| 1.2.3 化妆品领域 | 第20页 |
| 1.3 谷胱甘肽合成方法 | 第20-22页 |
| 1.3.1 发酵法 | 第20-21页 |
| 1.3.2 基因工程法 | 第21页 |
| 1.3.3 体外酶法生产谷胱甘肽 | 第21-22页 |
| 1.4 谷胱甘肽的检测方法 | 第22-23页 |
| 1.4.1 高效液相色谱法 | 第22页 |
| 1.4.2 分光光度法 | 第22-23页 |
| 1.5 多聚磷酸激酶 | 第23-25页 |
| 1.6 多聚磷酸激酶的应用 | 第25-26页 |
| 1.6.1 临床医药应用前景 | 第25页 |
| 1.6.2 工业生产 | 第25-26页 |
| 1.7 体外酶法生产谷胱甘肽的研究背景 | 第26-27页 |
| 1.7.1 酶耦合法生产谷胱甘肽 | 第26页 |
| 1.7.2 谷胱甘肽合成双功能酶 | 第26-27页 |
| 1.7.3 ATP再生系统 | 第27页 |
| 1.8 课题研究思路和目的 | 第27-30页 |
| 1.8.1 课题研究目的 | 第27-28页 |
| 1.8.2 课题思路 | 第28-30页 |
| 第二章 耦合体系中相关载体构建 | 第30-46页 |
| 2.1 引言 | 第30页 |
| 2.2 实验材料与仪器 | 第30-32页 |
| 2.2.1 菌种来源、载体质粒和引物 | 第30-31页 |
| 2.2.2 培养基 | 第31页 |
| 2.2.3 试剂和实验仪器 | 第31-32页 |
| 2.3 实验方法 | 第32-36页 |
| 2.3.1 构建pET28a-ppk共表达载体 | 第32-33页 |
| 2.3.2 构建pET22b-gs重组载体 | 第33-34页 |
| 2.3.3 构建pET22b-gs(His)和pET28a-ppk(His)重组载体 | 第34-35页 |
| 2.3.4 构建pETDuet-1-ppk(E.coil)重组载体 | 第35页 |
| 2.3.5 重组载体基因的异源表达 | 第35页 |
| 2.3.6 纯化加组氨酸标签的蛋白 | 第35-36页 |
| 2.3.7 蛋白含量检测及蛋白电泳 | 第36页 |
| 2.4 实验结果及讨论 | 第36-44页 |
| 2.4.1 构建pET28a-ppk共表达载体 | 第36-38页 |
| 2.4.2 构建pET22b-gs重组载体 | 第38-39页 |
| 2.4.3 构建pET22b-gs(His)和pET28a-ppk(His)重组载体 | 第39-41页 |
| 2.4.4 构建pETDuet-1-ppk(E.coil)重组载体 | 第41-42页 |
| 2.4.5 蛋白电泳检测表达蛋白 | 第42-44页 |
| 2.5 小结 | 第44-46页 |
| 第三章 耦合反应生成谷胱甘肽 | 第46-70页 |
| 3.1 引言 | 第46页 |
| 3.2 试剂与实验仪器 | 第46页 |
| 3.3 实验方法 | 第46-55页 |
| 3.3.1 PPK酶动力学参数测定方法 | 第46-49页 |
| 3.3.1.1 NADPH法测PPK酶活原理 | 第46-47页 |
| 3.3.1.2 合理构建由ATP到NADPH的合成途径 | 第47-48页 |
| 3.3.1.3 不同低聚磷酸盐对PPK酶活的影响 | 第48页 |
| 3.3.1.4 六偏磷酸为底物时测PPK的动力学参数 | 第48-49页 |
| 3.3.2 20 mM耦合反应体系研究 | 第49-50页 |
| 3.3.2.1 四氧嘧啶法测反应液中GSH含量 | 第49页 |
| 3.3.2.2 无氧反应条件的优化 | 第49-50页 |
| 3.3.3 正交实验探索反应关键因素 | 第50-51页 |
| 3.3.4 50 mM耦合反应体系中ATP浓度优化 | 第51页 |
| 3.3.5 高效液相法检测GSH | 第51-52页 |
| 3.3.6 50 mM耦合反应体系中聚磷酸种类优化 | 第52-53页 |
| 3.3.6.1 三聚磷酸作为磷酸供体参与耦合反应 | 第52页 |
| 3.3.6.2 四聚磷酸作为磷酸供体参与耦合反应 | 第52-53页 |
| 3.3.7 50 mM耦合反应体系中底物氨基酸比例优化 | 第53-54页 |
| 3.3.8 50 mM耦合反应体系中镁离子浓度优化 | 第54页 |
| 3.3.9 50 mM耦合反应体系中六偏磷酸浓度优化 | 第54页 |
| 3.3.10 纯化的酶催化耦合反应 | 第54-55页 |
| 3.4 实验结果及讨论 | 第55-67页 |
| 3.4.1 PPK酶动力学参数 | 第55-56页 |
| 3.4.1.1 三种聚磷酸为底物时多聚磷酸激酶的酶活 | 第55页 |
| 3.4.1.2 六偏磷酸为底物时多聚磷酸激酶动力学参数 | 第55-56页 |
| 3.4.2 氧气对耦合反应效果的影响 | 第56-57页 |
| 3.4.3 正交实验探索影响反应的主要因素 | 第57-58页 |
| 3.4.4 50 mM耦合反应条件优化 | 第58-61页 |
| 3.4.4.1 ATP浓度优化 | 第58-59页 |
| 3.4.4.2 底物氨基酸比例优化 | 第59-60页 |
| 3.4.4.3 镁离子浓度优化 | 第60页 |
| 3.4.4.4 六偏磷酸浓度优化 | 第60-61页 |
| 3.4.5 高效液相色谱法检测GSH含量 | 第61-63页 |
| 3.4.6 三聚磷酸和四聚磷酸在耦合反应中的作用 | 第63-66页 |
| 3.4.6.1 三聚磷酸对GS酶的作用 | 第63-65页 |
| 3.4.6.2 四聚磷酸对GS酶的作用 | 第65-66页 |
| 3.4.7 纯化后的PPK和GS对耦合反应的作用 | 第66-67页 |
| 3.5 小结 | 第67-70页 |
| 第四章 耦合反应体系放大生产谷胱甘肽 | 第70-78页 |
| 4.1 引言 | 第70页 |
| 4.2 试剂与实验仪器 | 第70-71页 |
| 4.2.1 菌种和培养基 | 第70页 |
| 4.2.2 试剂和仪器 | 第70-71页 |
| 4.3 实验方法 | 第71-75页 |
| 4.3.1 大肠杆菌来源的PPK参与耦合反应 | 第71-72页 |
| 4.3.2 高密度发酵条件研究 | 第72-74页 |
| 4.3.3 对发酵产生酶进行酶活检测 | 第74页 |
| 4.3.4 放大反应体积生产GSH | 第74-75页 |
| 4.4 实验结果及讨论 | 第75-77页 |
| 4.4.1 高密度发酵最适条件 | 第75-76页 |
| 4.4.2 反应体积扩大反应 | 第76页 |
| 4.4.3 产量及生产成本对比 | 第76-77页 |
| 4.5 小结 | 第77-78页 |
| 第五章 结论与展望 | 第78-80页 |
| 参考文献 | 第80-84页 |
| 附录一 实验涉及化学试剂 | 第84-86页 |
| 附录二 本实验所用设备仪器 | 第86-88页 |
| 附录三 蛋白纯化相关溶液配方 | 第88页 |
| 附录四 SDS-PAGE电泳胶配方 | 第88-90页 |
| 致谢 | 第90-92页 |
| 研究成果及已发表的学术论文 | 第92-94页 |
| 作者及导师简介 | 第94-95页 |
| 附件 | 第95-96页 |
