| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-7页 |
| 第一章 绪论 | 第20-30页 |
| 1.1 转氨酶 | 第20-23页 |
| 1.1.1 转氨酶简介 | 第20页 |
| 1.1.2 ω-转氨酶(ω-TA) | 第20-21页 |
| 1.1.3 转氨酶催化机制 | 第21-22页 |
| 1.1.4 转氨酶的分类 | 第22-23页 |
| 1.2 手性胺类药物 | 第23-25页 |
| 1.2.1 手性药物 | 第23页 |
| 1.2.2 手性药物的制备方法 | 第23页 |
| 1.2.3 手性胺类药物制备方法 | 第23-25页 |
| 1.3 R型ω-转氨酶研究进展 | 第25-27页 |
| 1.3.1 土壤样本中筛选具有R型ω-转氨酶活性菌株 | 第25-26页 |
| 1.3.2 一种新R型ω-转氨酶的纯化及克隆表达 | 第26页 |
| 1.3.3 经由计算机模拟挖掘新酶的方法 | 第26-27页 |
| 1.3.4 利用保守序列比对挖掘新酶方法 | 第27页 |
| 1.4 一种利用R型ω-转氨酶催化合成的手性胺类药物 | 第27-29页 |
| 1.4.1 手性胺类药物西他列汀介绍 | 第27-28页 |
| 1.4.2 西他列汀的合成方法 | 第28-29页 |
| 1.4.3 酶不对称催化合成西他列汀方法 | 第29页 |
| 1.5 课题研究目的及意义 | 第29-30页 |
| 第二章 洋葱伯克霍尔德氏菌中一种新R型ω-转氨酶的克隆表达与蛋白纯化 | 第30-44页 |
| 2.1 引言 | 第30-31页 |
| 2.2 本章主要研究内容 | 第31页 |
| 2.3 实验仪器与试剂 | 第31页 |
| 2.4 实验方法 | 第31-37页 |
| 2.4.1 洋葱伯克霍尔德氏菌全基因组的提取 | 第32页 |
| 2.4.2 目的片段扩增 | 第32-33页 |
| 2.4.3 pET22b-pdBC重组质粒的构建 | 第33-34页 |
| 2.4.4 pdBC的诱导表达 | 第34-35页 |
| 2.4.5 超声破碎细胞 | 第35页 |
| 2.4.6 SDS-PAGE凝胶电泳 | 第35页 |
| 2.4.7 pdBC的催化活性检测 | 第35-36页 |
| 2.4.8 转氨酶pdBC的纯化 | 第36页 |
| 2.4.9 转氨酶pdBC蛋白质浓度的测定 | 第36-37页 |
| 2.4.10 转氨酶pdBC酶活力测定 | 第37页 |
| 2.5 结果分析与讨论 | 第37-43页 |
| 2.5.1 pdBC目的片段扩增 | 第37-38页 |
| 2.5.2 pET22b-pdBC重组质粒的构建 | 第38-39页 |
| 2.5.3 pdBC诱导表达以及SDS-PAGE凝胶电泳检测目的蛋白 | 第39页 |
| 2.5.4 pdBC的催化活性检测 | 第39-40页 |
| 2.5.5 转氨酶pdBC的纯化 | 第40-41页 |
| 2.5.6 转氨酶pdBC蛋白质浓度的测定 | 第41-42页 |
| 2.5.7 转氨酶pdBC酶活力测定 | 第42-43页 |
| 2.6 本章小结 | 第43-44页 |
| 第三章 尖孢镰刀菌中一种新R型ω-转氨酶的克隆表达与蛋白纯化 | 第44-54页 |
| 3.1 引言 | 第44页 |
| 3.2 本章主要研究内容 | 第44-45页 |
| 3.3 实验仪器与试剂 | 第45页 |
| 3.4 实验方法 | 第45-47页 |
| 3.4.1 尖孢镰刀菌的恢复培养 | 第45页 |
| 3.4.2 尖孢镰刀菌基因组提取以及验证 | 第45页 |
| 3.4.3 目的片段phFO扩增 | 第45-46页 |
| 3.4.4 重组质粒pET22b-phFO的构建 | 第46页 |
| 3.4.5 重组蛋白hpFO的诱导表达 | 第46-47页 |
| 3.4.6 重组蛋白hpFO的纯化 | 第47页 |
| 3.4.7 hpFO催化活性的测定 | 第47页 |
| 3.4.8 转氨酶hpFO的酶活力测定 | 第47页 |
| 3.5 结果分析与讨论 | 第47-52页 |
| 3.5.1 尖孢镰刀菌基因组提取以及验证 | 第47-48页 |
| 3.5.2 目的片段hpFO扩增 | 第48页 |
| 3.5.3 重组质粒pET22b-hpFO的构建 | 第48-49页 |
| 3.5.4 重组蛋白hpFO的诱导表达 | 第49-51页 |
| 3.5.5 重组蛋白hpFO的纯化 | 第51页 |
| 3.5.6 hpFO催化活性检测以及转氨酶hpFO酶活力测定 | 第51-52页 |
| 3.6 本章小结 | 第52-54页 |
| 第四章 R型ω-转氨酶pdBC、hpFO的酶学性质研究 | 第54-68页 |
| 4.1 引言 | 第54页 |
| 4.2 本章主要研究内容 | 第54页 |
| 4.3 实验仪器与试剂 | 第54页 |
| 4.4 实验方法 | 第54-56页 |
| 4.4.1 不同pH对转氨酶pdBC、hpFO酶活的影响 | 第54-55页 |
| 4.4.2 不同温度对转氨酶pdBC、hpFO酶活的影响 | 第55页 |
| 4.4.3 转氨酶pdBC、hpFO温度稳定性研究 | 第55页 |
| 4.4.4 金属离子对pdBC、hpFO酶活的影响 | 第55页 |
| 4.4.5 转氨酶pdBC、hpFO米氏常数的测定 | 第55-56页 |
| 4.5 结果分析与讨论 | 第56-65页 |
| 4.5.1 不同pH对转氨酶pdBC、hpFO酶活的影响 | 第56-57页 |
| 4.5.2 不同温度对转氨酶pdBC、hpFO酶活的影响 | 第57-58页 |
| 4.5.3 转氨酶pdBC、hpFO热稳定性研究 | 第58-60页 |
| 4.5.4 金属离子对转氨酶pdBC、hpFO酶活影响 | 第60-61页 |
| 4.5.5 转氨酶pdBC、hpFO米氏常数的测定 | 第61-65页 |
| 4.6 本章小结 | 第65-68页 |
| 第五章 转氨酶pdBC、hpFO底物特异性研究 | 第68-84页 |
| 5.1 引言 | 第68页 |
| 5.2 本章主要研究内容 | 第68页 |
| 5.3 实验仪器与试剂 | 第68页 |
| 5.4 实验方法 | 第68-77页 |
| 5.4.1 3-(1-乙氨基)-苯酚的合成 | 第68-69页 |
| 5.4.2 (R)-3-(1-乙氨基)-苯酚的合成 | 第69页 |
| 5.4.3 1-(2-氟苯基)-乙胺的合成 | 第69-70页 |
| 5.4.4 1-(3-氯苯基)-乙胺的合成 | 第70页 |
| 5.4.5 1-(3-溴苯基)-乙胺的合成 | 第70-71页 |
| 5.4.6 3-氧4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸乙酯的合成 | 第71页 |
| 5.4.7 [3,4](亚甲基二氧)-苯丁酮的合成 | 第71-72页 |
| 5.4.8 3-氧-3-苯基-丙酸甲酯的合成 | 第72页 |
| 5.4.9 2-乙酰基-苯甲酸乙酯的合成 | 第72-73页 |
| 5.4.10 (R)-3-氨基4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸乙酯的合成 | 第73-75页 |
| 5.4.11 3-氨基-3-苯基-丙酸甲酯的合成 | 第75页 |
| 5.4.12 (4-氯苯基)-苯基-甲胺的合成 | 第75-76页 |
| 5.4.13 胺类化合物以及酮类化合物HPLC检测条件的确定 | 第76-77页 |
| 5.4.14 转氨酶pdBC、hpFO的氨基受体特异性研究 | 第77页 |
| 5.4.15 转氨酶pdBC、hpFO的氨基供体特异性研究 | 第77页 |
| 5.5 结果分析与讨论 | 第77-83页 |
| 5.5.1 几种胺类化合物以及酮类化合物的化学合成 | 第77-78页 |
| 5.5.2 胺类化合物以及酮类化合物HPLC检测条件的确定 | 第78-80页 |
| 5.5.3 转氨酶pdBC、hpFO的氨基受体特异性研究 | 第80-81页 |
| 5.5.4 转氨酶pdBC、hpFO的氨基供体特异性研究 | 第81-83页 |
| 5.6 本章小结 | 第83-84页 |
| 第六章 ATA-117在大肠杆菌以及毕赤酵母表达系统中的克隆表达以及ATA-117工程菌在西他列汀药物合成中的应用研究 | 第84-102页 |
| 6.1 引言 | 第84页 |
| 6.2 本章主要研究内容 | 第84页 |
| 6.3 实验仪器与试剂 | 第84页 |
| 6.4 实验方法 | 第84-90页 |
| 6.4.1 R型选择性转氨酶ATA-117在大肠杆菌宿主中克隆与重组表达 | 第84-85页 |
| 6.4.2 R型选择性转氨酶ATA-117在毕赤酵母宿主中克隆与重组表达 | 第85-88页 |
| 6.4.3 ATA-117在BL-21、Transetta大肠杆菌以及GS115毕赤酵母表达系统中的表达效果比较 | 第88-90页 |
| 6.5 结果分析与讨论 | 第90-101页 |
| 6.5.1 R型选择性转氨酶ATA-117在大肠杆菌宿主中克隆与重组表达 | 第90-92页 |
| 6.5.2 R型选择性转氨酶ATA-117在毕赤酵母宿主中克隆与重组表达 | 第92-98页 |
| 6.5.3 ATA-117在BL-21、Transetta大肠杆菌以及GS115毕赤酵母表达系统中表达的研究 | 第98-101页 |
| 6.6 本章小结 | 第101-102页 |
| 第七章 总结 | 第102-104页 |
| 参考文献 | 第104-108页 |
| 附录 | 第108-120页 |
| 致谢 | 第120-122页 |
| 研究成果及发表学术论文 | 第122-124页 |
| 作者与导师简介 | 第124-125页 |
| 附件 | 第125-126页 |
