| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 第一章 绪论 | 第10-20页 |
| 1.1 概述 | 第10-12页 |
| 1.1.1 透明质酸和透明质酸酶概述 | 第10-11页 |
| 1.1.2 透明质酸与透明质酸酶的应用 | 第11-12页 |
| 1.2 国内外研究状况 | 第12-17页 |
| 1.2.1 透明质酸的微生物合成进展 | 第12-14页 |
| 1.2.2 透明质酸酶的研究现状 | 第14-15页 |
| 1.2.3 小分子HA寡聚糖的制备 | 第15-17页 |
| 1.3 本论文主要研究内容 | 第17-20页 |
| 1.3.1 本论文立项依据及研究意义 | 第17-18页 |
| 1.3.2 本论文主要研究内容 | 第18-20页 |
| 第二章 水蛭透明质酸酶基因的克隆与性质表征 | 第20-38页 |
| 2.1 前言 | 第20页 |
| 2.2 材料与方法 | 第20-26页 |
| 2.2.1 菌株和质粒 | 第20-21页 |
| 2.2.2 试剂和药品 | 第21页 |
| 2.2.3 仪器和设备 | 第21-22页 |
| 2.2.4 培养基和培养条件 | 第22-23页 |
| 2.2.5 分子操作 | 第23-24页 |
| 2.2.6 菌株培养条件 | 第24-25页 |
| 2.2.7 H6LHyal蛋白纯化 | 第25页 |
| 2.2.8 LHyal酶学性质表征 | 第25页 |
| 2.2.9 小分子HA寡聚糖的制备和分析 | 第25页 |
| 2.2.10 检测分析方法 | 第25-26页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第26-36页 |
| 2.3.1 水蛭LHyal生物信息学分析 | 第26-30页 |
| 2.3.2 重组LHyal的高效分泌表达 | 第30-31页 |
| 2.3.3 重组水蛭LHyal酶学性质表征 | 第31-32页 |
| 2.3.4 水蛭LHyal水解HA过程解析 | 第32-36页 |
| 2.4 本章小结 | 第36-38页 |
| 第三章 重组Bacillus subtilis合成HA途径构建与优化 | 第38-52页 |
| 3.1 前言 | 第38页 |
| 3.2 材料与方法 | 第38-44页 |
| 3.2.1 菌株和质粒 | 第38-40页 |
| 3.2.2 试剂和药品 | 第40页 |
| 3.2.3 仪器设备 | 第40-41页 |
| 3.2.4 培养基 | 第41页 |
| 3.2.5 DNA操作 | 第41-42页 |
| 3.2.6 培养条件 | 第42-43页 |
| 3.2.7 检测方法 | 第43-44页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第44-49页 |
| 3.3.1 B. subtilis合成HA途径的构建 | 第44-46页 |
| 3.3.2 组合优化HA合成途径基因对HA产量的影响 | 第46-47页 |
| 3.3.3 下调糖酵解途径对HA产量的影响 | 第47-48页 |
| 3.3.4 优化HA合成途径基因对HA分子量的影响 | 第48-49页 |
| 3.4 本章小结 | 第49-52页 |
| 第四章 理性调控水蛭HAase高效合成HA寡聚糖 | 第52-68页 |
| 4.1 前言 | 第52页 |
| 4.2 材料与方法 | 第52-57页 |
| 4.2.1 菌株和质粒 | 第52-53页 |
| 4.2.2 试剂和药品 | 第53-54页 |
| 4.2.3 仪器设备 | 第54页 |
| 4.2.4 培养基和培养条件 | 第54-55页 |
| 4.2.5 DNA操作 | 第55-56页 |
| 4.2.6 分析方法 | 第56-57页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第57-66页 |
| 4.3.1 蛋白N端改造实现水蛭LHyal的活性功能表达 | 第57-60页 |
| 4.3.2 水蛭LHyal表达调控元件的筛选 | 第60-61页 |
| 4.3.3 理性调控水蛭LHyal表达合成小分子HA寡聚糖 | 第61-63页 |
| 4.3.4 3-L罐补料发酵对HA产量的影响 | 第63-65页 |
| 4.3.5 水蛭HAase表达水平对HA分子量的影响 | 第65-66页 |
| 4.4 本章小结 | 第66-68页 |
| 第五章 DNA多位点组合突变技术的构建 | 第68-84页 |
| 5.1 前言 | 第68页 |
| 5.2 材料与方法 | 第68-73页 |
| 5.2.1 菌株和质粒 | 第68-69页 |
| 5.2.2 试剂和药品 | 第69-71页 |
| 5.2.3 仪器设备 | 第71-72页 |
| 5.2.4 培养基和培养条件 | 第72页 |
| 5.2.5 DNA操作 | 第72页 |
| 5.2.6 高通量文库筛选和表征 | 第72-73页 |
| 5.2.7 分析方法 | 第73页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第73-81页 |
| 5.3.1 RECODE基本原理和特征 | 第73-74页 |
| 5.3.2 RECODE反应体系的优化 | 第74-77页 |
| 5.3.3 RECODE方法快速构建调控元件的突变文库 | 第77-78页 |
| 5.3.4 RECODE方法进化水蛭HAase | 第78-79页 |
| 5.3.5 RECODE方法组合优化合成途径 | 第79-81页 |
| 5.4 本章小结 | 第81-84页 |
| 第六章 高效无缝DNA组装技术的构建 | 第84-96页 |
| 6.1 前言 | 第84页 |
| 6.2 材料与方法 | 第84-87页 |
| 6.2.1 菌株和质粒 | 第84页 |
| 6.2.2 试剂和药品 | 第84-86页 |
| 6.2.3 仪器设备 | 第86页 |
| 6.2.4 培养基和培养条件 | 第86页 |
| 6.2.5 分子操作 | 第86-87页 |
| 6.2.6 分析方法 | 第87页 |
| 6.3 结果与讨论 | 第87-93页 |
| 6.3.1 DATEL基本原理和特征 | 第87-88页 |
| 6.3.2 DATEL反应参数优化 | 第88-90页 |
| 6.3.3 模型预测DATEL反应的最适退火温度 | 第90-91页 |
| 6.3.4 DATEL多片段组装 | 第91-92页 |
| 6.3.5 DATEL快速构建 β-carotene合成途径文库 | 第92-93页 |
| 6.4 本章小结 | 第93-96页 |
| 主要结论与展望 | 第96-98页 |
| 论文创新点 | 第98-100页 |
| 致谢 | 第100-102页 |
| 参考文献 | 第102-110页 |
| 附录I： 作者在攻读博士学位期间发表的论文 | 第110-111页 |
