| 致谢 | 第5-7页 |
| 摘要 | 第7-9页 |
| Abstract | 第9-10页 |
| 缩略词表 | 第11-20页 |
| 1 引言 | 第20-40页 |
| 1.1 泛素化系统 | 第20-30页 |
| 1.1.1 泛素化基本简介 | 第20-21页 |
| 1.1.2 泛素化系统的关键组成蛋白 | 第21-27页 |
| 1.1.2.1 泛素蛋白 | 第21-22页 |
| 1.1.2.2 E1泛素激活酶 | 第22-23页 |
| 1.1.2.3 E2泛素结合酶 | 第23-24页 |
| 1.1.2.4 E3泛素连接酶 | 第24-27页 |
| 1.1.3 多聚泛素化 | 第27-30页 |
| 1.2 泛素连接酶TRAF6 | 第30-38页 |
| 1.2.1 TRAF6基本概况 | 第30-31页 |
| 1.2.2 TRAF6基本结构 | 第31-32页 |
| 1.2.3 TRAF结构域识别特异蛋白序列 | 第32-33页 |
| 1.2.4 TRAF6在NF-κB信号通路中的调控 | 第33-35页 |
| 1.2.5 去泛素化酶负调控TRAF6 | 第35页 |
| 1.2.6 TRAF6参与信号通路的交叉 | 第35-36页 |
| 1.2.7 TRAF6合成自由多泛素链机制的探讨 | 第36-38页 |
| 1.3 NF-κB信号通路 | 第38-40页 |
| 1.3.1 NF-κB基本概况 | 第38页 |
| 1.3.2 NF-κB经典通路和非经典通路 | 第38-40页 |
| 2 材料和方法 | 第40-51页 |
| 2.1 材料 | 第40-42页 |
| 2.1.1 细胞系 | 第40页 |
| 2.1.2 主要试剂和抗体 | 第40-41页 |
| 2.1.3 主要载体及菌株 | 第41-42页 |
| 2.1.4 仪器设备和分析软件 | 第42页 |
| 2.2 方法 | 第42-51页 |
| 2.2.1 原核表达及真核表达载体的构建 | 第42-43页 |
| 2.2.2 细胞培养 | 第43-44页 |
| 2.2.3 细胞转染 | 第44页 |
| 2.2.4 稳定细胞系的构建 | 第44页 |
| 2.2.5 细胞内RNA的提取和实时定量PCR | 第44-45页 |
| 2.2.6 荧光素酶报告基因检测 | 第45页 |
| 2.2.7 免疫共沉淀 | 第45页 |
| 2.2.8 从JurkatT细胞中提取细胞裂解液S20和S100 | 第45-46页 |
| 2.2.9 蛋白表达和纯化 | 第46页 |
| 2.2.10 纯化细胞内的TAK1蛋白激酶复合体 | 第46-47页 |
| 2.2.11 TRAF6体外激活IKK | 第47页 |
| 2.2.12 TRAF6体外激活TAK1 | 第47页 |
| 2.2.13 TRAF6介导的体外泛素化合成 | 第47-48页 |
| 2.2.14 分离纯化K63多聚泛素化链 | 第48页 |
| 2.2.15 纯化的K63多聚泛素化链体外激活TAK1激酶 | 第48页 |
| 2.2.16 从体外和体内纯化K63连接的多聚泛素链 | 第48-49页 |
| 2.2.17 测定Ub～Ubc13的Km | 第49页 |
| 2.2.18 制备结合了Ub的GST-Ubc13 | 第49页 |
| 2.2.19 体外GST-Ubc13 pull down实验 | 第49-50页 |
| 2.2.20 统计学处理 | 第50-51页 |
| 3 实验结果 | 第51-83页 |
| 3.1 体外重建TRAF6介导的K63链合成反应体系 | 第51-52页 |
| 3.2 只有长的多泛素链才能激活TAK1蛋白激酶 | 第52-55页 |
| 3.3 鉴定影响TRAF6持续合成泛素链的结构域 | 第55-56页 |
| 3.4 Coiled-coil结构域与TRAF6酶活的关系 | 第56-59页 |
| 3.5 Coiled-coil结构域对TRAF6的功能非常重要 | 第59-61页 |
| 3.6 TRAF6是一个高效持续的泛素连接酶 | 第61-63页 |
| 3.7 CC结构域介导了TRAF6的processivity | 第63-66页 |
| 3.8 CC结构域介导TRAF6的寡聚化对TRAF6持续合成泛素链至关重要 | 第66-69页 |
| 3.9 破坏CC结构域介导的TRAF6的寡聚化,破坏TRAF6的功能 | 第69-71页 |
| 3.10 寡聚化的CC结构域能与Ubc13相互作用 | 第71-72页 |
| 3.11 构建破坏CC结构域与Ubc13相互作用的突变体 | 第72-74页 |
| 3.12 TRAF6高效合成泛素链需要寡聚化的CC结构域与Ubc13的相互作用 | 第74-77页 |
| 3.13 CC结构域可以与Ub～Ubc13相互作用 | 第77-78页 |
| 3.14 TRAF6和突变体稳定细胞系的筛选 | 第78-80页 |
| 3.15 CC结构域介导的寡聚化、与Ubc13相互作用的生物学功能 | 第80-81页 |
| 3.16 泛素连接酶TRAF6的工作模型 | 第81-83页 |
| 4 讨论 | 第83-88页 |
| 4.1 只有长多泛素链才可以激活TAK1蛋白激酶 | 第83-84页 |
| 4.2 CC结构域,寡聚化和持续合成(Processive) | 第84-88页 |
| 5 小结 | 第88-90页 |
| 附录 | 第90-98页 |
| 1 主要溶液配制 | 第90-95页 |
| 2 引物序列 | 第95-98页 |
| 参考文献 | 第98-112页 |
| 作者简历及在学期间所取得的科研成果 | 第112-113页 |
