| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5页 |
| 第一章 绪论 | 第10-15页 |
| 1 杆状病毒研究概况 | 第10-12页 |
| 1.1 杆状病毒基本特点 | 第10页 |
| 1.2 杆状病毒基因组研究概况 | 第10-11页 |
| 1.3 杆状病毒基因功能研究进展 | 第11-12页 |
| 2 家蚕杆状病毒重组外源蛋白表达系统简介 | 第12-13页 |
| 3 双荧光素酶报告系统简介 | 第13-14页 |
| 4 Red同源重组技术 | 第14-15页 |
| 第二章 实验方案 | 第15-18页 |
| 1 研究的目的和意义 | 第15页 |
| 2 研究的主要内容 | 第15-17页 |
| 3 技术路线 | 第17-18页 |
| 第三章 家蚕杆状病毒orf60基因的敲除与补回 | 第18-39页 |
| 1 材料与试剂 | 第18页 |
| 1.1 材料与仪器 | 第18页 |
| 1.2 试剂 | 第18页 |
| 2 方法 | 第18-33页 |
| 2.1 orf60基因序列分析 | 第18页 |
| 2.2 orf60基因的转录时相分析 | 第18-22页 |
| 2.2.1 细胞复苏和培养 | 第18-19页 |
| 2.2.2 活化病毒 | 第19页 |
| 2.2.3 用BmNPV感染家蚕BmN细胞 | 第19页 |
| 2.2.4 制备细胞样品 | 第19-20页 |
| 2.2.5 感染BmNPV细胞总RNA的提取 | 第20页 |
| 2.2.6 反转录合成cDNA第一链 | 第20-21页 |
| 2.2.7 基因引物的设计 | 第21页 |
| 2.2.8 orf60基因的转录时相 | 第21-22页 |
| 2.3 orf60缺失型病毒的构建 | 第22-28页 |
| 2.3.1 BW25113甘油菌的活化 | 第23页 |
| 2.3.2 pKD46质粒提取 | 第23-24页 |
| 2.3.3 DH10Bac甘油菌的活化 | 第24页 |
| 2.3.4 DH10Bac感受态的制备 | 第24页 |
| 2.3.5 pKD46质粒的转化 | 第24-25页 |
| 2.3.6 含pKD46质粒的DH10Bac感受态的制备 | 第25页 |
| 2.3.7 BmNPVorf60打靶片段的制备 | 第25-26页 |
| 2.3.8 orf60缺失型病毒的获得 | 第26-27页 |
| 2.3.9 orf60基因缺失型Bacmid的PCR鉴定 | 第27-28页 |
| 2.3.9.1 碱裂解法提取重组病毒基因组DNA | 第27页 |
| 2.3.9.2 交叉PCR鉴定 | 第27-28页 |
| 2.4 orf60补回型病毒的构建 | 第28-33页 |
| 2.4.1 构建转移载体pFastBacHTB-orf60 | 第28-31页 |
| 2.4.1.1 PCR扩增orf60基因 | 第28-29页 |
| 2.4.1.2 提取pFastBacHTB质粒 | 第29-30页 |
| 2.4.1.3 目的片段与pFastBacHTB载体的双酶切 | 第30页 |
| 2.4.1.4 连接反应 | 第30-31页 |
| 2.4.2 DH5α感受态的制备 | 第31页 |
| 2.4.3 orf60-ko-Bacmid病毒的转化 | 第31页 |
| 2.4.4 含orf60-ko-Bacmid的DH5α感受态细胞的制备 | 第31-32页 |
| 2.4.5 pFastbac HTB-orf60的转化 | 第32页 |
| 2.4.6 orf60基因补回型病毒的PCR鉴定 | 第32-33页 |
| 3 结果与分析 | 第33-38页 |
| 3.1 orf60基因序列分析 | 第33-34页 |
| 3.2 orf60基因的转录时相分析 | 第34-35页 |
| 3.3 orf60基因打靶片段的鉴定 | 第35页 |
| 3.4 orf60基因缺失型病毒的交叉PCR鉴定 | 第35-36页 |
| 3.5 orf60基因补回型病毒的交叉PCR鉴定 | 第36-37页 |
| 3.6 orf60基因缺失型病毒转染家蚕细胞的发病情况 | 第37-38页 |
| 4 讨论 | 第38-39页 |
| 第四章 orf60基因缺失对病毒转录水平的调控作用 | 第39-55页 |
| 1 材料与试剂 | 第39页 |
| 1.1 材料 | 第39页 |
| 1.2 试剂 | 第39页 |
| 2 方法 | 第39-48页 |
| 2.1 orf60基因缺失对病毒滴度的影响 | 第39-41页 |
| 2.1.1 复苏细胞 | 第39-40页 |
| 2.1.2 碱裂解法提取3种病毒Bacmid | 第40页 |
| 2.1.3 Bacmid转染BmN细胞 | 第40-41页 |
| 2.1.4 病毒滴度的测定 | 第41页 |
| 2.2 敲除orf60基因对BmNPV基因组复制的影响 | 第41-43页 |
| 2.2.1 提取病毒基因组 | 第41-42页 |
| 2.2.2 设计标记基因引物 | 第42页 |
| 2.2.3 绘制qPCR反应标准曲线 | 第42页 |
| 2.2.4 q-PCR检测病毒基因组的复制情况 | 第42-43页 |
| 2.3 敲除orf60基因对病毒基因转录的影响 | 第43-47页 |
| 2.3.1 q-PCR引物的设计 | 第43页 |
| 2.3.2 DH10Bac甘油菌的活化 | 第43-44页 |
| 2.3.3 碱裂解法提取Bacmid | 第44页 |
| 2.3.4 三种重组Bacmid转染BmN细胞 | 第44-45页 |
| 2.3.5 制备细胞样品 | 第45页 |
| 2.3.6 感染BmNPV细胞总RNA的提取 | 第45-46页 |
| 2.3.7 逆转录生成cDNA第一链 | 第46页 |
| 2.3.8 q-PCR检测orf60基因缺失对病毒基因转录的影响 | 第46-47页 |
| 2.4 双荧光素检测orf60基因缺失对多角体启动子的影响 | 第47-48页 |
| 2.4.1 orf60基因缺失型病毒双萤光素酶病毒载体的构建 | 第47页 |
| 2.4.2 野生型与缺失型双荧光素病毒载体的转染 | 第47页 |
| 2.4.3 细胞样品的收集 | 第47-48页 |
| 2.4.4 双萤光素酶报告基因活性检测 | 第48页 |
| 3 结果与分析 | 第48-53页 |
| 3.1 orf60基因缺失对病毒滴度的影响 | 第48-49页 |
| 3.2 敲除orf60基因对病毒基因组DNA复制的影响 | 第49-50页 |
| 3.3 orf60基因缺失对病毒基因转录的影响 | 第50-52页 |
| 3.4 orf60基因缺失对多角体启动子的影响 | 第52-53页 |
| 4 讨论 | 第53-55页 |
| 结论 | 第55-56页 |
| 参考文献 | 第56-60页 |
| 致谢 | 第60页 |
