| 摘要 | 第1-9页 |
| Abstract | 第9-11页 |
| 缩略词表 | 第11-12页 |
| 第一章 文献综述 | 第12-23页 |
| 1 DHV-1的病原学研究进展 | 第12-20页 |
| ·DHV-1致病特点 | 第12-13页 |
| ·DHV-1的分子生物学结构 | 第13-20页 |
| ·DHV-1的5'UTR | 第13-15页 |
| ·DHV-1的3'UTR | 第15页 |
| ·DHV-1结构蛋白的研究 | 第15-17页 |
| ·DHV-1的非结构蛋白 | 第17-18页 |
| ·DHV-1多聚蛋白的加工 | 第18-20页 |
| 2 DHV-1检测方法研究进展 | 第20-22页 |
| ·中和试验 | 第20页 |
| ·酶联免疫吸附试验 | 第20-21页 |
| ·琼脂扩散试验 | 第21页 |
| ·凝集试验 | 第21页 |
| ·胶体金技术 | 第21页 |
| ·分子生物学方法 | 第21-22页 |
| 3 研究的目的与意义 | 第22-23页 |
| 第二章 DHV-1JX株结构蛋白VP0基因的原核表达、纯化以及间接ELISA方法的建立 | 第23-55页 |
| 1 试验材料 | 第23-27页 |
| ·试验动物 | 第23页 |
| ·毒株、基因和血清 | 第23-24页 |
| ·质粒及菌株 | 第24页 |
| ·主要试剂与器材 | 第24页 |
| ·主要仪器设备 | 第24页 |
| ·主要溶液及其配制 | 第24-27页 |
| ·抗生素类 | 第24页 |
| ·细菌培养基类 | 第24-25页 |
| ·DNA琼脂糖凝胶电泳相关溶液 | 第25页 |
| ·蛋白表达与检测的相关溶液 | 第25-26页 |
| ·包涵体蛋白纯化相关溶液 | 第26页 |
| ·可溶性蛋白纯化相关溶液 | 第26页 |
| ·ELISA相关溶液 | 第26-27页 |
| 2 方法 | 第27-35页 |
| ·1型鸭肝炎弱毒的增殖、纯化与DHV-1间接ELISA方法的建立 | 第27页 |
| ·1型鸭肝炎弱毒病毒的增殖与纯化 | 第27页 |
| ·1型鸭肝炎弱毒病毒浓度鉴定 | 第27页 |
| ·DHV-1间接ELISA方法的建立 | 第27页 |
| ·重组表达质粒的构建 | 第27-29页 |
| ·带有粘性末端VP0基因片段和载体pGEX-KG的制备 | 第27-28页 |
| ·VP0基因与载体pGEX-KG的连接 #17混匀后,16℃连接过夜 | 第28页 |
| ·重组阳性表达质粒的筛选与鉴定 | 第28页 |
| ·重组质粒pGEX-KG-VP0的PCR鉴定 | 第28-29页 |
| ·重组质粒pGEX-KG-VP0的酶切鉴定 | 第29页 |
| ·重组质粒的序列测定 | 第29页 |
| ·重组表达质粒在E.coli BL21(DE3)菌中的诱导表达及检测 | 第29-31页 |
| ·SDS-PAGE电泳 | 第30页 |
| ·重组蛋白的可溶性分析 | 第30页 |
| ·包涵体形式蛋白的纯化 | 第30-31页 |
| ·可溶性蛋白的纯化 | 第31页 |
| ·纯化的可溶性VP0和包涵体VP0浓度的测定 | 第31页 |
| ·可溶性VP0以及包涵体VP0间接ELISA方法的建立 | 第31-35页 |
| ·重组蛋白VP0间接ELISA操作程序 | 第31页 |
| ·VP0间接ELISA最佳包被浓度和最佳血清工作浓度的确定 | 第31-32页 |
| ·最佳包被条件的确定 | 第32页 |
| ·最佳封闭时间的确定 | 第32页 |
| ·最佳血清工作时间的确定 | 第32页 |
| ·最佳酶标二抗工作浓度的确定 | 第32-33页 |
| ·最佳酶标二抗反应时间的确定 | 第33页 |
| ·最佳显色时间的确定 | 第33页 |
| ·阴阳性临界值的确定 | 第33页 |
| ·特异性试验 | 第33-34页 |
| ·标准曲线的建立 | 第34页 |
| ·重复性试验 | 第34页 |
| ·包被抗原保存期的确定 | 第34页 |
| ·盲样检测 | 第34页 |
| ·平行对比试验 | 第34-35页 |
| ·间接ELISA方法检测血清抗体的应用 | 第35页 |
| ·雏鸭母源抗体消长规律的变化 | 第35页 |
| ·血清学调查样品的检测 | 第35页 |
| 3 结果与分析 | 第35-51页 |
| ·1型鸭肝炎弱毒病毒的浓度鉴定 | 第35页 |
| ·DHV-1间接ELISA方法的建立 | 第35页 |
| ·重组表达质粒的PCR鉴定和酶切鉴定 | 第35-36页 |
| ·序列测定 | 第36页 |
| ·VP0的表达及SDS-PAGE分析 | 第36-37页 |
| ·VP0蛋白的可溶性分析 | 第37-38页 |
| ·包涵体蛋白和可溶性蛋白的纯化与浓度的测定 | 第38页 |
| ·可溶性VP0以及包涵体VP0间接ELISA方法的建立 | 第38-50页 |
| ·最佳包被浓度和血清最佳工作浓度的确定 | 第38-40页 |
| ·最佳包被条件的确定 | 第40-41页 |
| ·最佳封闭时间的确定 | 第41页 |
| ·最佳血清工作时间的确定 | 第41-42页 |
| ·最佳酶标二抗工作浓度的确定 | 第42-43页 |
| ·最佳酶标二抗工作时间的确定 | 第43页 |
| ·最佳显色时间的确定 | 第43-44页 |
| ·阴阳临界值的确定 | 第44页 |
| ·特异性试验 | 第44-45页 |
| ·重复性试验 | 第45-46页 |
| ·标准曲线的建立 | 第46-47页 |
| ·包被抗原保存期的确定 | 第47-48页 |
| ·盲样检测结果 | 第48-50页 |
| ·平行对比试验 | 第50页 |
| ·间接ELISA方法检测血清抗体的应用 | 第50-51页 |
| ·雏鸭母源抗体消长规律的变化 | 第50-51页 |
| ·血清学样品检测 | 第51页 |
| 4. 讨论 | 第51-55页 |
| ·表达载体的选择以及重组表达质粒在E.coliBL21中的诱导表达 | 第51-52页 |
| ·可溶性VP0的纯化 | 第52页 |
| ·间接ELISA方法的建立 | 第52-53页 |
| ·重组蛋白VP0-ELISA方法与病毒-ELISA方法的比较 | 第53-54页 |
| ·建立的可溶性VP0-ELISA、包涵体VP0-ELISA和病毒-ELISA方法的应用 | 第54-55页 |
| 结论 | 第55-56页 |
| 参考文献 | 第56-65页 |
| 致谢 | 第65页 |
