| 中文摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-12页 |
| 1 引言 | 第12-14页 |
| 2 材料、试剂与仪器 | 第14-18页 |
| ·菌株和细胞株 | 第14页 |
| ·主要试剂及配制 | 第14-16页 |
| ·主要仪器 | 第16-17页 |
| ·引物设计 | 第17-18页 |
| ·14-3-3σ基因全长引物 | 第17页 |
| ·排除野生型方法基因突变的引物设计 | 第17页 |
| ·插入pENTR~(TM)TOPO~(?)载体序列引物 | 第17-18页 |
| 3 方法与步骤 | 第18-31页 |
| ·总RNA的提取 | 第18页 |
| ·RT-PCR扩增14-3-3σ基因 | 第18-19页 |
| ·PCR产物凝胶回收 | 第19页 |
| ·连接测序载体和转化大肠杆菌 | 第19-20页 |
| ·挑取及鉴定阳性克隆 | 第20页 |
| ·质粒提取 | 第20页 |
| ·排除野生型法修正突变基因 | 第20-21页 |
| ·真核表达载体的构建 | 第21-22页 |
| ·食管鳞癌细胞系EC9706对G418敏感性实验 | 第22页 |
| ·脂质体稳定转染EC9706细胞株 | 第22-23页 |
| ·免疫印迹技术(Western blotting)检测转染细胞中的标签蛋白 | 第23-27页 |
| ·细胞总蛋白的提取 | 第23页 |
| ·总蛋白定量(BCA法) | 第23-24页 |
| ·蛋白质凝胶电泳 | 第24-25页 |
| ·Western blotting蛋白转印 | 第25-26页 |
| ·Western blotting检测蛋白复合体中V5标签蛋白 | 第26-27页 |
| ·串联亲和纯化(TAP)14-3-3σ蛋白复合体 | 第27-28页 |
| ·细胞准备及总蛋白的提取 | 第27页 |
| ·链霉素柱子的准备 | 第27页 |
| ·复合体的结合 | 第27页 |
| ·洗涤 | 第27-28页 |
| ·AcTEV~(TM)酶切 | 第28页 |
| ·蛋白复合体洗脱 | 第28页 |
| ·超滤去除AcTEV~(TM)酶 | 第28页 |
| ·纯化蛋白银染鉴定差异蛋白 | 第28-29页 |
| ·脱银、胶内酶切 | 第29-30页 |
| ·质谱鉴定 | 第30-31页 |
| 4 结果 | 第31-38页 |
| ·RT-PCR扩增14-3-3σ全长基因 | 第31页 |
| ·真核表达载体的构建 | 第31-32页 |
| ·表达pcDNA3.2载体稳定细胞株的建立及鉴定 | 第32-33页 |
| ·SDS-PAGE检测差异条带 | 第33-34页 |
| ·差异条带的胶内酶切和质谱鉴定 | 第34-38页 |
| 5 讨论 | 第38-42页 |
| 6 结论 | 第42-44页 |
| 参考文献 | 第44-65页 |
| 附录 | 第65-67页 |
| 致谢 | 第67-69页 |
| 在读期间发表的学术论文及研究成果 | 第69页 |
