| 摘要 | 第1-12页 |
| ABSTRACT | 第12-16页 |
| 缩写简表 | 第16-18页 |
| 第一章 绪论 | 第18-41页 |
| 1.糖生物学研究进展 | 第18-26页 |
| ·糖生物学的发展历程 | 第18-19页 |
| ·糖生物学的研究现状和展望 | 第19-20页 |
| ·寡糖链的生物学功能 | 第20-21页 |
| ·糖蛋白与蛋白糖基化 | 第21-24页 |
| ·糖链分析方法的研究进展 | 第24-26页 |
| 2.酿酒酵母糖基化的研究进展 | 第26-33页 |
| ·酿酒酵母在糖基化研究中的应用 | 第26-27页 |
| ·酿酒酵母的N-糖基化机制 | 第27-33页 |
| ·N-糖基化与酵母细胞形态 | 第33页 |
| 3.酵母细胞凋亡 | 第33-39页 |
| ·动物细胞凋亡的特征 | 第34页 |
| ·单细胞生物的凋亡 | 第34-35页 |
| ·酿酒酵母细胞调亡 | 第35-36页 |
| ·酿酒酵母细胞调亡的研究意义 | 第36-37页 |
| ·酿酒酵母细胞凋亡的特征 | 第37页 |
| ·外源性诱导的酵母凋亡 | 第37-38页 |
| ·内源性诱导的酵母凋亡 | 第38-39页 |
| ·酵母细胞凋亡的研究展望 | 第39页 |
| 4.本论文的研究工作 | 第39-41页 |
| 第二章 酿酒酵母糖基转移酶的基因敲除及糖基化分析 | 第41-62页 |
| 1.材料与方法 | 第42-51页 |
| ·质粒与菌株 | 第42页 |
| ·分子克隆用酶及试剂 | 第42页 |
| ·培养基配方 | 第42-43页 |
| ·主要仪器和设备 | 第43页 |
| ·溶液及配置 | 第43-44页 |
| ·酵母DNA的快速提取法 | 第44页 |
| ·选择性标记基因和同源片段的扩增 | 第44-45页 |
| ·PCR扩增片段的回收 | 第45页 |
| ·URA3,HIS3基因的TA克隆 | 第45页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第45-46页 |
| ·连接产物的大肠杆菌转化 | 第46页 |
| ·质粒的SDS碱裂解法制备 | 第46-47页 |
| ·同源置换DNA片段的重叠延伸PCR的构建 | 第47-48页 |
| ·融合片段PCR产物的琼脂糖凝胶回收 | 第48页 |
| ·酿酒酵母电转化菌体的制备 | 第48页 |
| ·线性DNA的酿酒酵母电转化 | 第48-49页 |
| ·重组子的基因组PCR筛选 | 第49页 |
| ·酿酒酵母细胞壁蛋白的制备 | 第49页 |
| ·甘露糖蛋白的分离 | 第49-50页 |
| ·N-糖链的释放(release)和纯化 | 第50页 |
| ·N-糖链的2-氨基(2-aminopyridine)衍生 | 第50-51页 |
| ·吡啶化糖链的HPLC和MALDITOFMS分析 | 第51页 |
| 2.结果与分析 | 第51-59页 |
| ·选择性标记基因及同源片段的扩增 | 第51-52页 |
| ·敲除线性DNA片段的构建 | 第52-53页 |
| ·酿酒酵母mnn1和mnn1och1突变菌株的构建 | 第53-55页 |
| ·酿酒酵母mnn1och1突变菌株的蛋白糖基化分析 | 第55-59页 |
| 3.讨论 | 第59-61页 |
| ·Ochlp和Mnnlp基因对酿酒酵母N-糖基化的影响 | 第59-60页 |
| ·N-糖链的磷酸化 | 第60页 |
| ·突变菌株的应用前景 | 第60-61页 |
| 4.本章小结 | 第61-62页 |
| 第三章 高尔基体糖基化缺陷对酵母细胞分裂的影响 | 第62-76页 |
| 1.材料与方法 | 第63-66页 |
| ·菌株 | 第63页 |
| ·主要试剂 | 第63页 |
| ·培养基及溶液配置 | 第63-64页 |
| ·主要仪器和设备 | 第64页 |
| ·生长曲线测定 | 第64页 |
| ·细胞核染色 | 第64页 |
| ·温度敏感性试验 | 第64-65页 |
| ·台盼蓝(trypan blue)染色 | 第65页 |
| ·聚集态生长的细胞分离 | 第65页 |
| ·细胞的阿利新兰(alcian blue)染色 | 第65-66页 |
| 2.结果与分析 | 第66-73页 |
| ·糖基化缺陷影响酿酒酵母的生长 | 第66-67页 |
| ·糖基化缺陷导致酿酒酵母细胞温度敏感 | 第67-70页 |
| ·糖基化缺陷影响酵母细胞分裂 | 第70-72页 |
| ·糖基化缺陷影响细胞表面负电荷密度 | 第72-73页 |
| 3.讨论 | 第73-75页 |
| ·突变菌株缺陷与糖链的不完整性相关 | 第73-74页 |
| ·细胞壁破坏导致突变菌株温度敏感性 | 第74-75页 |
| ·糖基化影响细胞分裂 | 第75页 |
| 4.本章小结 | 第75-76页 |
| 第四章 高尔基体糖基化缺陷与酵母细胞的死亡 | 第76-95页 |
| 1.材料与方法 | 第76-80页 |
| ·菌株与培养基 | 第77页 |
| ·主要试剂和仪器 | 第77页 |
| ·溶液及配制 | 第77页 |
| ·细胞活力检测 | 第77-78页 |
| ·刚果红敏感性试验 | 第78页 |
| ·Glucuronidase-lyticase敏感性实验 | 第78-79页 |
| ·细胞核fragment检测 | 第79页 |
| ·细胞凋亡DNA ladder检测 | 第79页 |
| ·磷脂酰丝氨酸外露(PS exposure)的FITC-annexin V染色 | 第79-80页 |
| ·活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)的测定 | 第80页 |
| 2.结果与分析 | 第80-89页 |
| ·糖基化突变对酵母细胞活力的影响 | 第80-82页 |
| ·mnn1 och1突变菌株细胞染色质浓缩(Chromatin condensation) | 第82-84页 |
| ·mnn1 och1突变菌株细胞膜磷脂酰丝氨酸外露 | 第84-86页 |
| ·糖基化突变导致细胞壁缺陷 | 第86-88页 |
| ·mnn1 och1突变菌株细胞内活性氧自由基的积累 | 第88-89页 |
| 3.讨论 | 第89-94页 |
| ·细胞壁缺陷导致突变菌株细胞大量坏死 | 第90页 |
| ·内质网糖基化与细胞凋亡 | 第90页 |
| ·高尔基体糖基化与细胞凋亡 | 第90-91页 |
| ·酵母糖基化诱导的细胞凋亡调控机制 | 第91-92页 |
| ·ROS在酵母细胞凋亡中的作用 | 第92页 |
| ·酵母糖基化缺陷ROS积累机制 | 第92-93页 |
| ·糖基化与细胞凋亡的研究展望 | 第93-94页 |
| 4.本章小结 | 第94-95页 |
| 第五章 干扰素在酿酒酵母中的克隆及表达 | 第95-108页 |
| 1.材料与试剂 | 第96-101页 |
| ·载体和菌株 | 第96页 |
| ·试剂和主要仪器 | 第96页 |
| ·培养基 | 第96-97页 |
| ·溶液的配制 | 第97-98页 |
| ·目的基因的PCR扩增 | 第98页 |
| ·YFD18质粒的SDS碱裂解法制备 | 第98页 |
| ·目的基因与载体的限制性内切酶消化 | 第98-99页 |
| ·单酶切克隆载体的去磷酸化 | 第99页 |
| ·目的基因与载体的连接反应及转化 | 第99页 |
| ·重组质粒的制备及正向插入的筛选 | 第99页 |
| ·重组质粒酵母细胞的转化 | 第99-100页 |
| ·酵母中质粒DNA的提取 | 第100页 |
| ·发酵液的浓缩处理 | 第100页 |
| ·酵母胞内蛋白样品的制备 | 第100页 |
| ·Western-blot | 第100-101页 |
| ·亲和层析纯化 | 第101页 |
| 2.结果与分析 | 第101-105页 |
| ·干扰素-β基因的扩增及重组载体的构建 | 第101-103页 |
| ·酿酒表达菌株的构建 | 第103-104页 |
| ·干扰素的表达及western blot分析 | 第104-105页 |
| 3.讨论 | 第105-107页 |
| ·mnn1 och1突变菌株在蛋白表达宿主菌中的应用 | 第106页 |
| ·HuIFN-β在酿洒酵母中的表达 | 第106-107页 |
| 4.本章小结 | 第107-108页 |
| References | 第108-124页 |
| 附表 | 第124-125页 |
| 致谢 | 第125-126页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第126-127页 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 | 第127-128页 |
| 英文文章 | 第128-166页 |
