霉菌脂肪酶基因的克隆与表达
| 摘要 | 第1-5页 |
| ABSTRACT | 第5-11页 |
| 第一章 文献综述 | 第11-25页 |
| ·脂肪酶简介 | 第11-13页 |
| ·脂肪酶的结构与催化机理 | 第11-12页 |
| ·微生物脂肪酶的水解特异性 | 第12-13页 |
| ·位置特异性 | 第12页 |
| ·脂肪酸特异性 | 第12-13页 |
| ·立体特异性 | 第13页 |
| ·脂肪酶的应用 | 第13-14页 |
| ·脂肪酶的应用概况 | 第13页 |
| ·脂肪酶生产单甘酯的研究 | 第13-14页 |
| ·微生物脂肪酶的生产菌种及改造研究 | 第14-16页 |
| ·脂肪酶活力测定方法 | 第16-18页 |
| ·以天然油脂为底物的测定方法 | 第16-17页 |
| ·测量产生的脂肪酸 | 第17页 |
| ·测量产生的甘油 | 第17页 |
| ·以人工合成化合物为底物 | 第17-18页 |
| ·脂肪酶的分子生物学研究 | 第18-21页 |
| ·细菌脂肪酶 | 第18-19页 |
| ·真菌脂肪酶 | 第19-21页 |
| ·大肠杆菌表达系统 | 第21-24页 |
| ·大肠杆菌表达系统的优点 | 第21-22页 |
| ·大肠杆菌表达系统的缺点 | 第22页 |
| ·各种类型大肠杆菌表达系统的构成及特点 | 第22-23页 |
| ·大肠杆菌表达系统研究进展 | 第23-24页 |
| ·小结 | 第24-25页 |
| 第二章 米曲酶脂肪酶基因的克隆 | 第25-41页 |
| ·实验仪器与材料 | 第25-27页 |
| ·实验仪器 | 第25-26页 |
| ·载体与菌株 | 第26页 |
| ·酶及主要药品 | 第26-27页 |
| ·溶液组成及配制 | 第27页 |
| ·质粒DNA提取试剂 | 第27页 |
| ·培养基 | 第27页 |
| ·实验方法 | 第27-35页 |
| ·米曲霉总RNA的提取 | 第27-28页 |
| ·紫外光谱分析法测定RNA纯度 | 第28页 |
| ·反转录CDNA第一链 | 第28-29页 |
| ·PCR扩增米曲霉脂肪酶基因 | 第29-31页 |
| ·引物的设计 | 第29页 |
| ·PCR扩增目的基因 | 第29-30页 |
| ·PCR产物的纯化 | 第30-31页 |
| ·重组质粒pUCmT-mdlB的构建 | 第31-32页 |
| ·CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞 | 第32-33页 |
| ·重组质粒pUCmT-mdlB的转化 | 第33页 |
| ·重组质粒的初步鉴定 | 第33-35页 |
| ·碱裂解法小规模抽提质粒DNA | 第33-34页 |
| ·菌落PCR初步鉴定重组子 | 第34-35页 |
| ·重组质粒pUCmT-mdlB双酶切鉴定 | 第35页 |
| ·mdlB基因测序 | 第35页 |
| ·结果与讨论 | 第35-37页 |
| ·总RNA的提取 | 第35-36页 |
| ·总RNA的纯度 | 第36页 |
| ·米曲霉脂肪酶基因PCR扩增结果 | 第36-37页 |
| ·阳性转化子的鉴定 | 第37页 |
| ·重组质粒基因序列测定 | 第37页 |
| ·改进的实验方案与结果 | 第37-39页 |
| ·米曲霉基因组DNA的提取 | 第37-38页 |
| ·紫外光谱分析法测定米曲霉基因组DNA的纯度 | 第38页 |
| ·米曲霉基因组DNA的电泳鉴定 | 第38-39页 |
| ·以米曲霉基因组DNA为模板扩增目的基因mdlB | 第39页 |
| ·小结 | 第39-41页 |
| 第三章 米根霉脂肪酶基因ROL在大肠杆菌中的表达 | 第41-53页 |
| ·实验材料与方法 | 第41-47页 |
| ·实验方法 | 第41-42页 |
| ·质粒与菌株 | 第41页 |
| ·引物 | 第41-42页 |
| ·实验方法 | 第42-47页 |
| ·PCR克隆脂肪酶基因ROL | 第42页 |
| ·构建表达载体 | 第42-44页 |
| ·感受态细胞的制备与转化 | 第44页 |
| ·重组子的筛选 | 第44-45页 |
| ·IPTG诱导脂肪酶基因在大肠杆菌中的表达 | 第45页 |
| ·表达产物的SDS-PAGE电泳检测 | 第45-47页 |
| ·重组脂肪酶活力的测定 | 第47页 |
| ·结果与讨论 | 第47-50页 |
| ·PCR产物ROIA和ROL4.2电泳图 | 第47-48页 |
| ·菌液PCR检测转化子 | 第48-49页 |
| ·表达产物的SDS-PAGE电泳检测 | 第49-50页 |
| ·重组脂肪酶活力的测定 | 第50页 |
| ·小结 | 第50-53页 |
| 第四章 脂肪酶活力测定方法的比较与改进 | 第53-61页 |
| ·引言 | 第53页 |
| ·实验仪器 | 第53页 |
| ·实验试剂 | 第53页 |
| ·实验方法 | 第53-56页 |
| ·滴定法 | 第53-54页 |
| ·实验原理 | 第53-54页 |
| ·实验步骤 | 第54页 |
| ·酶活定义及计算公式 | 第54页 |
| ·铜皂法 | 第54-55页 |
| ·实验原理 | 第54-55页 |
| ·实验方法 | 第55页 |
| ·酶活定义及计算公式 | 第55页 |
| ·改进后的脂肪酶活力测定方法 | 第55页 |
| ·对硝基苯酚法 | 第55-56页 |
| ·实验原理 | 第56页 |
| ·实验方法 | 第56页 |
| ·改进后的对硝基苯酚法 | 第56页 |
| ·酶活定义及计算公式 | 第56页 |
| ·结果与讨论 | 第56-60页 |
| ·实验结果 | 第56-60页 |
| ·两种方法标准曲线 | 第57页 |
| ·三种方法测定结果比较 | 第57-60页 |
| ·结果分析与讨论 | 第60页 |
| ·关于两种脂肪酶酶活性测定方法在数值上的替代性 | 第60页 |
| ·对硝基苯酚法终止方法的讨论 | 第60页 |
| ·小结 | 第60-61页 |
| 第五章 结论与展望 | 第61-63页 |
| ·实验总 | 第61页 |
| ·问题与建议 | 第61-63页 |
| 参考文献 | 第63-67页 |
| 附录 | 第67-69页 |
| 致谢 | 第69-71页 |
| 研究成果及发表的学术论文 | 第71-73页 |
| 作者及导师简介 | 第73-74页 |
| 硕士研究生学位论文答辩委员会决议书 | 第74-75页 |
