摘要 | 第1-15页 |
Abstract | 第15-17页 |
中英文缩写表 | 第17-18页 |
第一章 DNA螺旋酶研究进展 | 第18-41页 |
·DNA拓扑异构酶的分类与功能 | 第18-21页 |
·DNA拓扑异构酶分类 | 第18-20页 |
·DNA拓扑异构酶功能 | 第20-21页 |
·DNA螺旋酶的功能 | 第21页 |
·DNA螺旋酶的功能区域 | 第21-24页 |
·酶活性中心 | 第21-22页 |
·GyrA蛋白的功能区域 | 第22-23页 |
·GyrB蛋白的功能区域 | 第23-24页 |
·DNA螺旋酶的晶体结构 | 第24-26页 |
·GyrB-NTD的晶体结构 | 第24页 |
·GyrA-NTD的晶体结构 | 第24-25页 |
·GyrA-CTD的晶体结构 | 第25-26页 |
·DNA螺旋酶酶活性 | 第26-29页 |
·ATP酶活性 | 第26-27页 |
·超螺旋活性和松弛活性 | 第27-28页 |
·解缠绕反应 | 第28页 |
·DNA结合反应 | 第28页 |
·DNA断裂反应 | 第28-29页 |
·DNA螺旋酶的作用机理 | 第29-32页 |
·DNA螺旋酶研究中存在的问题与展望 | 第32-34页 |
·螺旋酶反应机理有待于继续研究 | 第32-33页 |
·螺旋酶的三维结构有待于继续解析 | 第33页 |
·需鉴定螺旋酶的DNA结合活性位点 | 第33-34页 |
·需阐述螺旋酶GyrA-CTD的功能作用 | 第34页 |
·DNA螺旋酶与结核病防治 | 第34-40页 |
·结核病发病趋势 | 第34-35页 |
·全球结核病流行概况 | 第34-35页 |
·我国结核病流行状况 | 第35页 |
·结核病防治现状 | 第35-37页 |
·结核病治疗方法与治疗药物 | 第36-37页 |
·我国结核病防治现状 | 第37页 |
·结核病防治中存在的问题与展望 | 第37-39页 |
·结核分枝杆菌致病机理不清楚 | 第37-38页 |
·缺乏有效药物进行治疗 | 第38页 |
·耐药性菌株大量出现 | 第38-39页 |
·研究DNA螺旋酶对结核病防治的意义 | 第39-40页 |
·有利于阐述结核分枝杆菌的生物学特性 | 第39页 |
·有利于阐述螺旋酶的酶反应机理 | 第39-40页 |
·有利于结核分枝杆菌的新药设计 | 第40页 |
·本课题的研究目的与计划 | 第40-41页 |
第二章 结核分枝杆菌螺旋酶A、B亚基生物信息分析 | 第41-67页 |
·前言 | 第41-42页 |
·试验方法 | 第42-43页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶的基因和蛋白质序列查询 | 第42页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶的基因和蛋白质序列同源序列搜索与比对 | 第42页 |
·结核分枝杆菌与大肠杆菌和包氏螺旋体菌的螺旋酶蛋白序列比对 | 第42页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶的蛋白质结构分析 | 第42-43页 |
·结果与分析 | 第43-65页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶基因序列的基本信息 | 第43-44页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶基因序列的同源性分析 | 第44-48页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶gyrB核苷酸序列的BLASTN结果 | 第44-46页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶gyrA核苷酸序列的BLASTN结果 | 第46-48页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶蛋白序列的同源性分析 | 第48-52页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶GyrB蛋白序列的BLASTP结果 | 第48-50页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶GyrA蛋白序列的BLASTP结果 | 第50-52页 |
·结核分枝杆菌与大肠杆菌和包氏螺旋体菌的螺旋酶蛋白序列比对 | 第52-57页 |
·三种菌体的GyrB蛋白序列比对 | 第52-54页 |
·三种菌体的GyrA蛋白序列比对 | 第54-57页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶A、B亚基的蛋白结构分析 | 第57-65页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶A、B亚基的蛋白一级结构分析 | 第57页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶A、B亚基的蛋白二级结构分析 | 第57-60页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶A、B亚基的蛋白三级结构分析 | 第60-65页 |
·讨论 | 第65-66页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶的基因富含GC | 第65页 |
·蛋白序列的差异可能导致蛋白酶学特性的差异 | 第65-66页 |
·结论 | 第66-67页 |
第三章 结核分枝杆菌螺旋酶的基因克隆表达与蛋白纯化及酶活性研究 | 第67-99页 |
·前言 | 第67-70页 |
·材料与方法 | 第70-82页 |
·试验材料 | 第70-73页 |
·菌株与质粒 | 第70-71页 |
·培养基 | 第71页 |
·试剂 | 第71-72页 |
·SDS-PAGE电泳用溶液及缓冲液 | 第72-73页 |
·实验仪器 | 第73页 |
·实验方法 | 第73-82页 |
·结核分枝杆菌基因组的提取 | 第73-74页 |
·大肠杆菌质粒的提取 | 第74页 |
·PCR扩增结核分枝杆菌螺旋酶基因 | 第74-77页 |
·从结核分枝杆菌基因组中扩增螺旋酶基因 | 第74-75页 |
·PCR扩增用于蛋白表达的螺旋酶基因 | 第75页 |
·利用Overlap PCR构建野生型螺旋酶gyrA基因 | 第75-76页 |
·基因片断加尾与连接 | 第76-77页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶基因的克隆载体与表达载体的构建 | 第77页 |
·pGEM-T-gyrA和pGEM-T-gyrB载体的构建 | 第77页 |
·pET32a-gyrB载体的构建 | 第77页 |
·pET20b-gyrA载体的构建 | 第77页 |
·大肠杆菌的转化 | 第77-78页 |
·重组质粒的筛选、验证 | 第78页 |
·蛋白质的诱导成 | 第78页 |
·蛋白质的大量表达与纯化 | 第78-79页 |
·SDS-PAGE分析蛋白纯度及分子量 | 第79-80页 |
·蛋白质的浓度测定 | 第80页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶全酶的重组 | 第80页 |
·螺旋酶DNA超螺旋活性的测定 | 第80页 |
·螺旋酶DNA松弛活性的测定 | 第80-81页 |
·螺旋酶DNA断裂活性的测定 | 第81-82页 |
·结果与分析 | 第82-97页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶gyrA和gyrB克隆载体的构建 | 第82-85页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶gyrA和gyrB从基因组的克隆 | 第82-83页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶gyrA和gyrB克隆载体的构建 | 第83-84页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶gyrA克隆载体的验证 | 第84页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶gyrB克隆载体的验证 | 第84-85页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶gyrA和gyrB表达载体的构建 | 第85-90页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶gyrA和gyrB从克隆载体的克隆 | 第85-86页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶gyrA表达载体的构建与验证 | 第86-88页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶gyrB表达载体的构建与验证 | 第88-90页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶GyrA和GyrB蛋白的表达 | 第90-91页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶GyrA蛋白的表达 | 第90-91页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶GyrB蛋白的表达 | 第91页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶GyrA和GyrB蛋白的大量表达与纯化 | 第91-93页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶GyrA蛋白的大量表达与纯化 | 第91-92页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶GyrB蛋白的大量表达与纯化 | 第92-93页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶的活性鉴定 | 第93-95页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶的DNA松弛活性 | 第93页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶的DNA超螺旋活性 | 第93-94页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶的DNA断裂活性 | 第94-95页 |
·影响结核分枝杆菌螺旋酶酶活性的因素 | 第95-97页 |
·不同温度对超螺旋活性的影响 | 第95页 |
·GyrA和GyrB亚基不同摩尔比对超螺旋活性的影响 | 第95-96页 |
·不同反应时间对松弛活性的影响 | 第96-97页 |
·讨论 | 第97-98页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶可以进行异源表达 | 第97页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶具有较特殊的酶反应条件 | 第97-98页 |
·结论 | 第98-99页 |
第四章 结核分枝杆菌螺旋酶GyrA亚基结合双链DNA的特性研究 | 第99-122页 |
·前言 | 第99-102页 |
·材料与方法 | 第102-106页 |
·试验材料 | 第102-103页 |
·所用的菌种与质粒 | 第102页 |
·培养基 | 第102页 |
·试剂 | 第102页 |
·SDS-PAGE电泳用溶液及缓冲液 | 第102-103页 |
·实验仪器 | 第103页 |
·试验方法 | 第103-106页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶酶GyrA功能区域分析 | 第103页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶GyrA蛋白亚基的基因扩增 | 第103-104页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶GyrA蛋白亚基的表达载体构建 | 第104页 |
·大肠杆菌的转化 | 第104页 |
·重组质粒的筛选、检测 | 第104页 |
·大肠杆菌质粒的提取 | 第104页 |
·蛋白质的诱导生成 | 第104页 |
·蛋白质的大量表达与纯化 | 第104-105页 |
·SDS-PAGE分析蛋白纯度及分子量 | 第105页 |
·蛋白质的浓度测定 | 第105页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶全酶的重组方法 | 第105页 |
·螺旋酶DNA结合活性的测定 | 第105-106页 |
·结果与分析 | 第106-119页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶各亚基表达载体的构建 | 第106-107页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶gyrAn表达载体的构建 | 第106页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶gyrAc表达载体的构建 | 第106-107页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶各亚基的蛋白表达与纯化 | 第107-108页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶不同结构域的DNA结合活性 | 第108-109页 |
·几种结合条件对结核分枝杆菌螺旋酶GyrA亚基结合DNA的影响 | 第109-111页 |
·温度对结核分枝杆菌螺旋酶GyrA亚基结合DNA的影响 | 第109页 |
·pH值对结核分枝杆菌螺旋酶GyrA亚基结合DNA的影响 | 第109-110页 |
·不同结合时间对结核分枝杆菌螺旋酶GyrA亚基结合DNA的影响 | 第110页 |
·蛋白浓度对结核分枝杆菌螺旋酶GyrA亚基结合DNA的影响 | 第110-111页 |
·离子条件对结核分枝杆菌螺旋酶GyrA亚基结合DNA的影响 | 第111-113页 |
·钠离子对结核分枝杆菌螺旋酶GyrA亚基结合DNA的影响 | 第111-112页 |
·不同镁离子浓度对结核分枝杆菌螺旋酶GyrA亚基结合DNA的影响 | 第112页 |
·不同钾离子浓度对结核分枝杆菌螺旋酶GyrA亚基结合DNA的影响 | 第112-113页 |
·钙离子对结核分枝杆菌螺旋酶GyrA亚基结合DNA的影响 | 第113页 |
·抑制剂对结核分枝杆菌螺旋酶GyrA亚基结合DNA的影响 | 第113-115页 |
·不同EDTA浓度对结核分枝杆菌螺旋酶GyrA亚基结合DNA的影响 | 第113-114页 |
·不同诺氟沙星浓度对结核分枝杆菌螺旋酶GyrA亚基结合DNA的影响 | 第114-115页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶GyrA亚基与其他蛋白的DNA结合活性比较 | 第115-117页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶GyrA亚基与几种核酸酶的DNA结合活性比较 | 第115-116页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶GyrA亚基与几种限制性内切酶的DNA结合活性比较 | 第116页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶GyrA亚基与几种蛋白质的DNA结合活性比较 | 第116-117页 |
·DNA对结核分枝杆菌螺旋酶GyrA亚基结合DNA的影响 | 第117-119页 |
·DNA拓扑结构对螺旋酶GyrA亚基结合DNA的影响 | 第117-118页 |
·DNA长度对螺旋酶GyrA亚基结合DNA的影响 | 第118-119页 |
·讨论 | 第119-121页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶GyrA-NTD也可以结合DNA | 第119页 |
·高温使结核分枝杆菌螺旋酶GyrA蛋白丧失DNA结合活性 | 第119-120页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶GyrA不能耐受高盐 | 第120页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶GyrA结合DNA的机理需继续研究 | 第120-121页 |
·结论 | 第121-122页 |
第五章 利用SPR检测结核分枝杆菌螺旋酶DNA结合特性 | 第122-156页 |
·前言 | 第122-125页 |
·材料与方法 | 第125-133页 |
·试验材料 | 第125-127页 |
·所用的菌种与质粒 | 第125-126页 |
·培养基 | 第126页 |
·试剂 | 第126页 |
·SDS-PAGE电泳用溶液及缓冲液 | 第126-127页 |
·实验仪器 | 第127页 |
·实验方法 | 第127-133页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶酶活性位点分析 | 第127-128页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶GyrA蛋白各突变体的基因扩增 | 第128-130页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶gyrA各突变体的表达载体构建 | 第130页 |
·大肠杆菌的转化 | 第130-131页 |
·重组质粒的筛选、检测 | 第131页 |
·大肠杆菌质粒的提取 | 第131页 |
·蛋白质的诱导生成 | 第131页 |
·蛋白质的大量表达与纯化 | 第131页 |
·SDS-PAGE分析蛋白纯度及分子量 | 第131页 |
·蛋白质的浓度测定 | 第131页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶全酶的重组方法 | 第131页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶GyrA亚基分子形式的分析 | 第131-132页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶与DNA相互作用的检测 | 第132-133页 |
·结果与分析 | 第133-152页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶活性中心突变体的构建 | 第133-134页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶活性中心突变体蛋白的表达与纯化 | 第134页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶GyrA蛋白的分子形式 | 第134-136页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶各亚基的DNA结合活性 | 第136-138页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶GyrB亚基的DNA结合常数 | 第138-139页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶不同形式的GyrA亚基的DNA结合常数 | 第139-142页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶混合型GyrA亚基的DNA结合常数 | 第139-140页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶GyrA单体的DNA结合常数 | 第140-141页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶GyrA双体的DNA结合常数 | 第141-142页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶重组酶的DNA结合常数 | 第142-143页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶不同形式GyrA与其重组酶的DNA结合活性比较 | 第143-145页 |
·活性中心突变对结核分枝杆菌螺旋酶DNA结合活性的影响 | 第145-147页 |
·活性中心位点突变的GyrA亚基DNA结合活性 | 第145-146页 |
·活性中心位点突变体重组酶的DNA结合活性 | 第146-147页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶GyrA-CTD中活性位点突变体的DNA结合活性 | 第147-149页 |
·GyrA突变体亚基的DNA结合活性 | 第147-148页 |
·突变体重组酶的DNA结合活性 | 第148-149页 |
·镁离子对结核分枝杆菌螺旋酶DNA结合活性的影响 | 第149-152页 |
·无镁离子对螺旋酶DNA结合活性的影响 | 第149-151页 |
·镁离子对螺旋酶GyrA双体DNA结合活性的影响 | 第151-152页 |
·讨论 | 第152-155页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶GyrB亚基是单链DNA结合蛋白 | 第152-153页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶GyrA亚基是双链DNA结合蛋白 | 第153页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶GyrA-NTD与GyrA-CTD在结合DNA中的作用 | 第153-154页 |
·镁离子对结核分枝杆菌螺旋酶结合DNA是非必需的 | 第154-155页 |
·结论 | 第155-156页 |
第六章 结核分枝杆菌螺旋酶GyrA-CTD中DNA结合活性位点的鉴定 | 第156-181页 |
·前言 | 第156-158页 |
·材料与方法 | 第158-164页 |
·试验材料 | 第158-159页 |
·所用的菌种与质粒 | 第158-159页 |
·培养基 | 第159页 |
·试剂 | 第159页 |
·SDS-PAGE电泳用溶液及缓冲液 | 第159页 |
·实验仪器 | 第159页 |
·实验方法 | 第159-164页 |
·螺旋酶GyrA-CTD亚基蛋白序列的保守性分析 | 第159页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶gyrA基因C端突变体的构建 | 第159-162页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶gyrA各突变体表达载体的构建 | 第162页 |
·大肠杆菌的转化 | 第162页 |
·重组质粒的筛选、检测 | 第162页 |
·大肠杆菌质粒的提取 | 第162页 |
·蛋白质的诱导生成 | 第162页 |
·蛋白质的大量表达与纯化 | 第162页 |
·SDS-PAGE分析蛋白纯度及分子量 | 第162页 |
·蛋白质的浓度测定 | 第162-163页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶全酶的重组方法 | 第163页 |
·螺旋酶DNA结合活性的测定 | 第163页 |
·螺旋酶DNA超螺旋活性的测定 | 第163页 |
·螺旋酶DNA松弛活性的测定 | 第163页 |
·螺旋酶DNA断裂活性的测定 | 第163页 |
·螺旋酶解缠绕活性的测定 | 第163页 |
·螺旋酶ATP酶活性的测定 | 第163页 |
·螺旋酶与DNA相互作用的检测 | 第163-164页 |
·试验结果 | 第164-177页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶GyrA-CTD蛋白序列的同源性比对 | 第164-165页 |
·GyrA-CTD中保守氨基酸在蛋白晶体三维结构上的定位 | 第165-167页 |
·GyrA-CTD突变体表达载体的构建 | 第167-168页 |
·结核分枝杆菌GyrA突变体蛋白的表达与纯化 | 第168-169页 |
·结核分枝杆菌GyrA突变体亚蛋白的DNA结合活性 | 第169-170页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶突变体全酶的DNA结合活性 | 第170-171页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶突变体的超螺旋活性 | 第171-172页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶突变体的松弛活性 | 第172页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶突变体的药物断裂活性 | 第172-173页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶突变体的解缠绕活性 | 第173-174页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶突变体的ATPase活性 | 第174-175页 |
·SPR检测结核分枝杆菌螺旋酶突变体与DNA的相互作用 | 第175-177页 |
·讨论 | 第177-180页 |
·GyrA-CTD中的第三片状结构是结核分枝杆菌螺旋酶最主要的DNA结合域 | 第177-178页 |
·GyrA-CTD参与了结核分枝杆菌螺旋酶的松弛反应和超螺旋反应 | 第178-179页 |
·GyrB对螺旋酶结合DNA活性的作用 | 第179页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶的ATPase活性 | 第179-180页 |
·结核分枝杆菌GyrA-CTD可作为一个有潜力的药物靶标 | 第180页 |
·结论 | 第180-181页 |
第七章 结核分枝杆菌螺旋酶耐药双突变体结合DNA的特性研究 | 第181-201页 |
·前言 | 第181-183页 |
·材料与方法 | 第183-187页 |
·试验材料 | 第183-184页 |
·所用的菌种与质粒 | 第183页 |
·培养基 | 第183页 |
·试剂 | 第183页 |
·SDS-PAGE电泳用溶液及缓冲液 | 第183-184页 |
·实验仪器 | 第184页 |
·实验方法 | 第184-187页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶GyrA亚基耐药突变热点位置分析 | 第184页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶gyrA耐药双突变体的基因扩增 | 第184-185页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶gyrA90-94突变体表达载体的构建 | 第185页 |
·大肠杆菌的转化 | 第185页 |
·重组质粒的筛选、检测 | 第185页 |
·大肠杆菌质粒的提取 | 第185页 |
·蛋白质的诱导生成 | 第185页 |
·蛋白质的大量表达与纯化 | 第185-186页 |
·SDS-PAGE分析蛋白纯度及分子量 | 第186页 |
·蛋白质的浓度测定 | 第186页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶全酶的重组方法 | 第186页 |
·螺旋酶DNA结合活性的测定 | 第186页 |
·螺旋酶DNA超螺旋活性的测定 | 第186页 |
·螺旋酶DNA松弛活性的测定 | 第186页 |
·螺旋酶ATP酶活性的测定 | 第186页 |
·螺旋酶与DNA相互作用的检测 | 第186-187页 |
·试验结果 | 第187-197页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶耐药双突变体构建 | 第187-188页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶耐药双突变体蛋白表达与纯化 | 第188页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶耐药双突变体超螺旋活性 | 第188-189页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶耐药双突变体ATPase活性 | 第189-190页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶GyrA90-94亚基的DNA结合活性 | 第190-193页 |
·螺旋酶GyrA90-94亚基的单链DNA结合活性 | 第190-191页 |
·螺旋酶GyrA90-94亚基的双链DNA结合活性 | 第191-193页 |
·结核分枝杆菌螺旋酶耐药双突变重组酶的DNA结合活性 | 第193-195页 |
·螺旋酶耐药双突变重组酶的单链DNA结合活性 | 第193-194页 |
·螺旋酶耐药双突变重组酶的双链DNA结合活性 | 第194-195页 |
·诺氟沙星的DNA结合活性 | 第195-197页 |
·讨论 | 第197-200页 |
·耐药双突变促进结核分枝杆菌螺旋酶结合DNA | 第197页 |
·诺氟沙星具有单链和双链DNA弱结合活性 | 第197-198页 |
·诺氟沙星杀菌新机理 | 第198-199页 |
·耐药双突变体的耐药新机理 | 第199-200页 |
·结论 | 第200-201页 |
参考文献 | 第201-213页 |
致谢 | 第213-214页 |
附录 | 第214页 |