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结核分枝杆菌螺旋酶与DNA的相互作用研究

摘要第1-15页
Abstract第15-17页
中英文缩写表第17-18页
第一章 DNA螺旋酶研究进展第18-41页
   ·DNA拓扑异构酶的分类与功能第18-21页
     ·DNA拓扑异构酶分类第18-20页
     ·DNA拓扑异构酶功能第20-21页
   ·DNA螺旋酶的功能第21页
   ·DNA螺旋酶的功能区域第21-24页
     ·酶活性中心第21-22页
     ·GyrA蛋白的功能区域第22-23页
     ·GyrB蛋白的功能区域第23-24页
   ·DNA螺旋酶的晶体结构第24-26页
     ·GyrB-NTD的晶体结构第24页
     ·GyrA-NTD的晶体结构第24-25页
     ·GyrA-CTD的晶体结构第25-26页
   ·DNA螺旋酶酶活性第26-29页
     ·ATP酶活性第26-27页
     ·超螺旋活性和松弛活性第27-28页
     ·解缠绕反应第28页
     ·DNA结合反应第28页
     ·DNA断裂反应第28-29页
   ·DNA螺旋酶的作用机理第29-32页
   ·DNA螺旋酶研究中存在的问题与展望第32-34页
     ·螺旋酶反应机理有待于继续研究第32-33页
     ·螺旋酶的三维结构有待于继续解析第33页
     ·需鉴定螺旋酶的DNA结合活性位点第33-34页
     ·需阐述螺旋酶GyrA-CTD的功能作用第34页
   ·DNA螺旋酶与结核病防治第34-40页
     ·结核病发病趋势第34-35页
       ·全球结核病流行概况第34-35页
       ·我国结核病流行状况第35页
     ·结核病防治现状第35-37页
       ·结核病治疗方法与治疗药物第36-37页
       ·我国结核病防治现状第37页
     ·结核病防治中存在的问题与展望第37-39页
       ·结核分枝杆菌致病机理不清楚第37-38页
       ·缺乏有效药物进行治疗第38页
       ·耐药性菌株大量出现第38-39页
     ·研究DNA螺旋酶对结核病防治的意义第39-40页
       ·有利于阐述结核分枝杆菌的生物学特性第39页
       ·有利于阐述螺旋酶的酶反应机理第39-40页
       ·有利于结核分枝杆菌的新药设计第40页
   ·本课题的研究目的与计划第40-41页
第二章 结核分枝杆菌螺旋酶A、B亚基生物信息分析第41-67页
   ·前言第41-42页
   ·试验方法第42-43页
     ·结核分枝杆菌螺旋酶的基因和蛋白质序列查询第42页
     ·结核分枝杆菌螺旋酶的基因和蛋白质序列同源序列搜索与比对第42页
     ·结核分枝杆菌与大肠杆菌和包氏螺旋体菌的螺旋酶蛋白序列比对第42页
     ·结核分枝杆菌螺旋酶的蛋白质结构分析第42-43页
   ·结果与分析第43-65页
     ·结核分枝杆菌螺旋酶基因序列的基本信息第43-44页
     ·结核分枝杆菌螺旋酶基因序列的同源性分析第44-48页
       ·结核分枝杆菌螺旋酶gyrB核苷酸序列的BLASTN结果第44-46页
       ·结核分枝杆菌螺旋酶gyrA核苷酸序列的BLASTN结果第46-48页
     ·结核分枝杆菌螺旋酶蛋白序列的同源性分析第48-52页
       ·结核分枝杆菌螺旋酶GyrB蛋白序列的BLASTP结果第48-50页
       ·结核分枝杆菌螺旋酶GyrA蛋白序列的BLASTP结果第50-52页
     ·结核分枝杆菌与大肠杆菌和包氏螺旋体菌的螺旋酶蛋白序列比对第52-57页
       ·三种菌体的GyrB蛋白序列比对第52-54页
       ·三种菌体的GyrA蛋白序列比对第54-57页
     ·结核分枝杆菌螺旋酶A、B亚基的蛋白结构分析第57-65页
       ·结核分枝杆菌螺旋酶A、B亚基的蛋白一级结构分析第57页
       ·结核分枝杆菌螺旋酶A、B亚基的蛋白二级结构分析第57-60页
       ·结核分枝杆菌螺旋酶A、B亚基的蛋白三级结构分析第60-65页
   ·讨论第65-66页
     ·结核分枝杆菌螺旋酶的基因富含GC第65页
     ·蛋白序列的差异可能导致蛋白酶学特性的差异第65-66页
   ·结论第66-67页
第三章 结核分枝杆菌螺旋酶的基因克隆表达与蛋白纯化及酶活性研究第67-99页
   ·前言第67-70页
   ·材料与方法第70-82页
     ·试验材料第70-73页
       ·菌株与质粒第70-71页
       ·培养基第71页
       ·试剂第71-72页
       ·SDS-PAGE电泳用溶液及缓冲液第72-73页
       ·实验仪器第73页
     ·实验方法第73-82页
       ·结核分枝杆菌基因组的提取第73-74页
       ·大肠杆菌质粒的提取第74页
       ·PCR扩增结核分枝杆菌螺旋酶基因第74-77页
         ·从结核分枝杆菌基因组中扩增螺旋酶基因第74-75页
         ·PCR扩增用于蛋白表达的螺旋酶基因第75页
         ·利用Overlap PCR构建野生型螺旋酶gyrA基因第75-76页
         ·基因片断加尾与连接第76-77页
       ·结核分枝杆菌螺旋酶基因的克隆载体与表达载体的构建第77页
         ·pGEM-T-gyrA和pGEM-T-gyrB载体的构建第77页
         ·pET32a-gyrB载体的构建第77页
         ·pET20b-gyrA载体的构建第77页
       ·大肠杆菌的转化第77-78页
       ·重组质粒的筛选、验证第78页
       ·蛋白质的诱导成第78页
       ·蛋白质的大量表达与纯化第78-79页
       ·SDS-PAGE分析蛋白纯度及分子量第79-80页
       ·蛋白质的浓度测定第80页
       ·结核分枝杆菌螺旋酶全酶的重组第80页
       ·螺旋酶DNA超螺旋活性的测定第80页
       ·螺旋酶DNA松弛活性的测定第80-81页
       ·螺旋酶DNA断裂活性的测定第81-82页
   ·结果与分析第82-97页
     ·结核分枝杆菌螺旋酶gyrA和gyrB克隆载体的构建第82-85页
       ·结核分枝杆菌螺旋酶gyrA和gyrB从基因组的克隆第82-83页
       ·结核分枝杆菌螺旋酶gyrA和gyrB克隆载体的构建第83-84页
       ·结核分枝杆菌螺旋酶gyrA克隆载体的验证第84页
       ·结核分枝杆菌螺旋酶gyrB克隆载体的验证第84-85页
     ·结核分枝杆菌螺旋酶gyrA和gyrB表达载体的构建第85-90页
       ·结核分枝杆菌螺旋酶gyrA和gyrB从克隆载体的克隆第85-86页
       ·结核分枝杆菌螺旋酶gyrA表达载体的构建与验证第86-88页
       ·结核分枝杆菌螺旋酶gyrB表达载体的构建与验证第88-90页
     ·结核分枝杆菌螺旋酶GyrA和GyrB蛋白的表达第90-91页
       ·结核分枝杆菌螺旋酶GyrA蛋白的表达第90-91页
       ·结核分枝杆菌螺旋酶GyrB蛋白的表达第91页
     ·结核分枝杆菌螺旋酶GyrA和GyrB蛋白的大量表达与纯化第91-93页
       ·结核分枝杆菌螺旋酶GyrA蛋白的大量表达与纯化第91-92页
       ·结核分枝杆菌螺旋酶GyrB蛋白的大量表达与纯化第92-93页
     ·结核分枝杆菌螺旋酶的活性鉴定第93-95页
       ·结核分枝杆菌螺旋酶的DNA松弛活性第93页
       ·结核分枝杆菌螺旋酶的DNA超螺旋活性第93-94页
       ·结核分枝杆菌螺旋酶的DNA断裂活性第94-95页
     ·影响结核分枝杆菌螺旋酶酶活性的因素第95-97页
       ·不同温度对超螺旋活性的影响第95页
       ·GyrA和GyrB亚基不同摩尔比对超螺旋活性的影响第95-96页
       ·不同反应时间对松弛活性的影响第96-97页
   ·讨论第97-98页
     ·结核分枝杆菌螺旋酶可以进行异源表达第97页
     ·结核分枝杆菌螺旋酶具有较特殊的酶反应条件第97-98页
   ·结论第98-99页
第四章 结核分枝杆菌螺旋酶GyrA亚基结合双链DNA的特性研究第99-122页
   ·前言第99-102页
   ·材料与方法第102-106页
     ·试验材料第102-103页
       ·所用的菌种与质粒第102页
       ·培养基第102页
       ·试剂第102页
       ·SDS-PAGE电泳用溶液及缓冲液第102-103页
       ·实验仪器第103页
     ·试验方法第103-106页
       ·结核分枝杆菌螺旋酶酶GyrA功能区域分析第103页
       ·结核分枝杆菌螺旋酶GyrA蛋白亚基的基因扩增第103-104页
       ·结核分枝杆菌螺旋酶GyrA蛋白亚基的表达载体构建第104页
       ·大肠杆菌的转化第104页
       ·重组质粒的筛选、检测第104页
       ·大肠杆菌质粒的提取第104页
       ·蛋白质的诱导生成第104页
       ·蛋白质的大量表达与纯化第104-105页
       ·SDS-PAGE分析蛋白纯度及分子量第105页
       ·蛋白质的浓度测定第105页
       ·结核分枝杆菌螺旋酶全酶的重组方法第105页
       ·螺旋酶DNA结合活性的测定第105-106页
   ·结果与分析第106-119页
     ·结核分枝杆菌螺旋酶各亚基表达载体的构建第106-107页
       ·结核分枝杆菌螺旋酶gyrAn表达载体的构建第106页
       ·结核分枝杆菌螺旋酶gyrAc表达载体的构建第106-107页
     ·结核分枝杆菌螺旋酶各亚基的蛋白表达与纯化第107-108页
     ·结核分枝杆菌螺旋酶不同结构域的DNA结合活性第108-109页
     ·几种结合条件对结核分枝杆菌螺旋酶GyrA亚基结合DNA的影响第109-111页
       ·温度对结核分枝杆菌螺旋酶GyrA亚基结合DNA的影响第109页
       ·pH值对结核分枝杆菌螺旋酶GyrA亚基结合DNA的影响第109-110页
       ·不同结合时间对结核分枝杆菌螺旋酶GyrA亚基结合DNA的影响第110页
       ·蛋白浓度对结核分枝杆菌螺旋酶GyrA亚基结合DNA的影响第110-111页
     ·离子条件对结核分枝杆菌螺旋酶GyrA亚基结合DNA的影响第111-113页
       ·钠离子对结核分枝杆菌螺旋酶GyrA亚基结合DNA的影响第111-112页
       ·不同镁离子浓度对结核分枝杆菌螺旋酶GyrA亚基结合DNA的影响第112页
       ·不同钾离子浓度对结核分枝杆菌螺旋酶GyrA亚基结合DNA的影响第112-113页
       ·钙离子对结核分枝杆菌螺旋酶GyrA亚基结合DNA的影响第113页
     ·抑制剂对结核分枝杆菌螺旋酶GyrA亚基结合DNA的影响第113-115页
       ·不同EDTA浓度对结核分枝杆菌螺旋酶GyrA亚基结合DNA的影响第113-114页
       ·不同诺氟沙星浓度对结核分枝杆菌螺旋酶GyrA亚基结合DNA的影响第114-115页
     ·结核分枝杆菌螺旋酶GyrA亚基与其他蛋白的DNA结合活性比较第115-117页
       ·结核分枝杆菌螺旋酶GyrA亚基与几种核酸酶的DNA结合活性比较第115-116页
       ·结核分枝杆菌螺旋酶GyrA亚基与几种限制性内切酶的DNA结合活性比较第116页
       ·结核分枝杆菌螺旋酶GyrA亚基与几种蛋白质的DNA结合活性比较第116-117页
     ·DNA对结核分枝杆菌螺旋酶GyrA亚基结合DNA的影响第117-119页
       ·DNA拓扑结构对螺旋酶GyrA亚基结合DNA的影响第117-118页
       ·DNA长度对螺旋酶GyrA亚基结合DNA的影响第118-119页
   ·讨论第119-121页
     ·结核分枝杆菌螺旋酶GyrA-NTD也可以结合DNA第119页
     ·高温使结核分枝杆菌螺旋酶GyrA蛋白丧失DNA结合活性第119-120页
     ·结核分枝杆菌螺旋酶GyrA不能耐受高盐第120页
     ·结核分枝杆菌螺旋酶GyrA结合DNA的机理需继续研究第120-121页
   ·结论第121-122页
第五章 利用SPR检测结核分枝杆菌螺旋酶DNA结合特性第122-156页
   ·前言第122-125页
   ·材料与方法第125-133页
     ·试验材料第125-127页
       ·所用的菌种与质粒第125-126页
       ·培养基第126页
       ·试剂第126页
       ·SDS-PAGE电泳用溶液及缓冲液第126-127页
       ·实验仪器第127页
       ·实验方法第127-133页
       ·结核分枝杆菌螺旋酶酶活性位点分析第127-128页
       ·结核分枝杆菌螺旋酶GyrA蛋白各突变体的基因扩增第128-130页
       ·结核分枝杆菌螺旋酶gyrA各突变体的表达载体构建第130页
       ·大肠杆菌的转化第130-131页
       ·重组质粒的筛选、检测第131页
       ·大肠杆菌质粒的提取第131页
       ·蛋白质的诱导生成第131页
       ·蛋白质的大量表达与纯化第131页
       ·SDS-PAGE分析蛋白纯度及分子量第131页
       ·蛋白质的浓度测定第131页
       ·结核分枝杆菌螺旋酶全酶的重组方法第131页
       ·结核分枝杆菌螺旋酶GyrA亚基分子形式的分析第131-132页
       ·结核分枝杆菌螺旋酶与DNA相互作用的检测第132-133页
   ·结果与分析第133-152页
     ·结核分枝杆菌螺旋酶活性中心突变体的构建第133-134页
     ·结核分枝杆菌螺旋酶活性中心突变体蛋白的表达与纯化第134页
     ·结核分枝杆菌螺旋酶GyrA蛋白的分子形式第134-136页
     ·结核分枝杆菌螺旋酶各亚基的DNA结合活性第136-138页
     ·结核分枝杆菌螺旋酶GyrB亚基的DNA结合常数第138-139页
     ·结核分枝杆菌螺旋酶不同形式的GyrA亚基的DNA结合常数第139-142页
       ·结核分枝杆菌螺旋酶混合型GyrA亚基的DNA结合常数第139-140页
       ·结核分枝杆菌螺旋酶GyrA单体的DNA结合常数第140-141页
       ·结核分枝杆菌螺旋酶GyrA双体的DNA结合常数第141-142页
     ·结核分枝杆菌螺旋酶重组酶的DNA结合常数第142-143页
     ·结核分枝杆菌螺旋酶不同形式GyrA与其重组酶的DNA结合活性比较第143-145页
     ·活性中心突变对结核分枝杆菌螺旋酶DNA结合活性的影响第145-147页
       ·活性中心位点突变的GyrA亚基DNA结合活性第145-146页
       ·活性中心位点突变体重组酶的DNA结合活性第146-147页
     ·结核分枝杆菌螺旋酶GyrA-CTD中活性位点突变体的DNA结合活性第147-149页
       ·GyrA突变体亚基的DNA结合活性第147-148页
       ·突变体重组酶的DNA结合活性第148-149页
     ·镁离子对结核分枝杆菌螺旋酶DNA结合活性的影响第149-152页
       ·无镁离子对螺旋酶DNA结合活性的影响第149-151页
       ·镁离子对螺旋酶GyrA双体DNA结合活性的影响第151-152页
   ·讨论第152-155页
     ·结核分枝杆菌螺旋酶GyrB亚基是单链DNA结合蛋白第152-153页
     ·结核分枝杆菌螺旋酶GyrA亚基是双链DNA结合蛋白第153页
     ·结核分枝杆菌螺旋酶GyrA-NTD与GyrA-CTD在结合DNA中的作用第153-154页
     ·镁离子对结核分枝杆菌螺旋酶结合DNA是非必需的第154-155页
   ·结论第155-156页
第六章 结核分枝杆菌螺旋酶GyrA-CTD中DNA结合活性位点的鉴定第156-181页
   ·前言第156-158页
   ·材料与方法第158-164页
     ·试验材料第158-159页
       ·所用的菌种与质粒第158-159页
       ·培养基第159页
       ·试剂第159页
       ·SDS-PAGE电泳用溶液及缓冲液第159页
       ·实验仪器第159页
       ·实验方法第159-164页
       ·螺旋酶GyrA-CTD亚基蛋白序列的保守性分析第159页
       ·结核分枝杆菌螺旋酶gyrA基因C端突变体的构建第159-162页
       ·结核分枝杆菌螺旋酶gyrA各突变体表达载体的构建第162页
       ·大肠杆菌的转化第162页
       ·重组质粒的筛选、检测第162页
       ·大肠杆菌质粒的提取第162页
       ·蛋白质的诱导生成第162页
       ·蛋白质的大量表达与纯化第162页
       ·SDS-PAGE分析蛋白纯度及分子量第162页
       ·蛋白质的浓度测定第162-163页
       ·结核分枝杆菌螺旋酶全酶的重组方法第163页
       ·螺旋酶DNA结合活性的测定第163页
       ·螺旋酶DNA超螺旋活性的测定第163页
       ·螺旋酶DNA松弛活性的测定第163页
       ·螺旋酶DNA断裂活性的测定第163页
       ·螺旋酶解缠绕活性的测定第163页
       ·螺旋酶ATP酶活性的测定第163页
       ·螺旋酶与DNA相互作用的检测第163-164页
   ·试验结果第164-177页
     ·结核分枝杆菌螺旋酶GyrA-CTD蛋白序列的同源性比对第164-165页
     ·GyrA-CTD中保守氨基酸在蛋白晶体三维结构上的定位第165-167页
     ·GyrA-CTD突变体表达载体的构建第167-168页
     ·结核分枝杆菌GyrA突变体蛋白的表达与纯化第168-169页
     ·结核分枝杆菌GyrA突变体亚蛋白的DNA结合活性第169-170页
     ·结核分枝杆菌螺旋酶突变体全酶的DNA结合活性第170-171页
     ·结核分枝杆菌螺旋酶突变体的超螺旋活性第171-172页
     ·结核分枝杆菌螺旋酶突变体的松弛活性第172页
     ·结核分枝杆菌螺旋酶突变体的药物断裂活性第172-173页
     ·结核分枝杆菌螺旋酶突变体的解缠绕活性第173-174页
     ·结核分枝杆菌螺旋酶突变体的ATPase活性第174-175页
     ·SPR检测结核分枝杆菌螺旋酶突变体与DNA的相互作用第175-177页
   ·讨论第177-180页
     ·GyrA-CTD中的第三片状结构是结核分枝杆菌螺旋酶最主要的DNA结合域第177-178页
     ·GyrA-CTD参与了结核分枝杆菌螺旋酶的松弛反应和超螺旋反应第178-179页
     ·GyrB对螺旋酶结合DNA活性的作用第179页
     ·结核分枝杆菌螺旋酶的ATPase活性第179-180页
     ·结核分枝杆菌GyrA-CTD可作为一个有潜力的药物靶标第180页
   ·结论第180-181页
第七章 结核分枝杆菌螺旋酶耐药双突变体结合DNA的特性研究第181-201页
   ·前言第181-183页
   ·材料与方法第183-187页
     ·试验材料第183-184页
       ·所用的菌种与质粒第183页
       ·培养基第183页
       ·试剂第183页
       ·SDS-PAGE电泳用溶液及缓冲液第183-184页
       ·实验仪器第184页
     ·实验方法第184-187页
       ·结核分枝杆菌螺旋酶GyrA亚基耐药突变热点位置分析第184页
       ·结核分枝杆菌螺旋酶gyrA耐药双突变体的基因扩增第184-185页
       ·结核分枝杆菌螺旋酶gyrA90-94突变体表达载体的构建第185页
       ·大肠杆菌的转化第185页
       ·重组质粒的筛选、检测第185页
       ·大肠杆菌质粒的提取第185页
       ·蛋白质的诱导生成第185页
       ·蛋白质的大量表达与纯化第185-186页
       ·SDS-PAGE分析蛋白纯度及分子量第186页
       ·蛋白质的浓度测定第186页
       ·结核分枝杆菌螺旋酶全酶的重组方法第186页
       ·螺旋酶DNA结合活性的测定第186页
       ·螺旋酶DNA超螺旋活性的测定第186页
       ·螺旋酶DNA松弛活性的测定第186页
       ·螺旋酶ATP酶活性的测定第186页
       ·螺旋酶与DNA相互作用的检测第186-187页
   ·试验结果第187-197页
     ·结核分枝杆菌螺旋酶耐药双突变体构建第187-188页
     ·结核分枝杆菌螺旋酶耐药双突变体蛋白表达与纯化第188页
     ·结核分枝杆菌螺旋酶耐药双突变体超螺旋活性第188-189页
     ·结核分枝杆菌螺旋酶耐药双突变体ATPase活性第189-190页
     ·结核分枝杆菌螺旋酶GyrA90-94亚基的DNA结合活性第190-193页
       ·螺旋酶GyrA90-94亚基的单链DNA结合活性第190-191页
       ·螺旋酶GyrA90-94亚基的双链DNA结合活性第191-193页
     ·结核分枝杆菌螺旋酶耐药双突变重组酶的DNA结合活性第193-195页
       ·螺旋酶耐药双突变重组酶的单链DNA结合活性第193-194页
       ·螺旋酶耐药双突变重组酶的双链DNA结合活性第194-195页
     ·诺氟沙星的DNA结合活性第195-197页
   ·讨论第197-200页
     ·耐药双突变促进结核分枝杆菌螺旋酶结合DNA第197页
     ·诺氟沙星具有单链和双链DNA弱结合活性第197-198页
     ·诺氟沙星杀菌新机理第198-199页
     ·耐药双突变体的耐药新机理第199-200页
   ·结论第200-201页
参考文献第201-213页
致谢第213-214页
附录第214页

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