| 中文摘要 | 第1-17页 |
| 英文摘要 | 第17-22页 |
| 第一章 文献综述 | 第22-46页 |
| ·引言 | 第22-23页 |
| ·紫杉醇简介 | 第23-24页 |
| ·红豆杉简介 | 第24-25页 |
| ·紫杉醇生物合成 | 第25-29页 |
| ·萜类前体IPP 的生物合成 | 第25-27页 |
| ·紫杉醇骨架及侧链的生物合成 | 第27-29页 |
| ·紫杉醇的来源 | 第29-33页 |
| ·天然红豆杉植物提取 | 第29页 |
| ·化学合成 | 第29-30页 |
| ·紫杉醇的全合成 | 第29-30页 |
| ·紫杉醇的半合成 | 第30页 |
| ·植物组织细胞培养 | 第30-31页 |
| ·微生物发酵法 | 第31页 |
| ·从山榛等植物中提取紫杉醇 | 第31-32页 |
| ·基因工程 | 第32-33页 |
| ·产紫杉醇内生真菌研究进展 | 第33-40页 |
| ·植物内生真菌简介 | 第33-34页 |
| ·利用微生物发酵生产紫杉醇的优点 | 第34页 |
| ·发酵液中紫杉醇的检测 | 第34页 |
| ·产紫杉醇内生真菌的分离概述 | 第34-37页 |
| ·提高内生真菌产紫杉醇产量的途径 | 第37-40页 |
| ·优化发酵培养条件 | 第38页 |
| ·培养基中添加诱导物 | 第38-39页 |
| ·在真菌培养基中添加代谢产物合成抑制剂 | 第39页 |
| ·前体饲喂 | 第39-40页 |
| ·基因工程技术构建高产紫杉醇工程菌株 | 第40页 |
| ·丝状真菌的遗传转化的主要方法 | 第40-41页 |
| ·构建高产紫杉醇内生菌株的REMI 技术 | 第41-45页 |
| ·REMI 转化的一般步骤 | 第42-43页 |
| ·原生质体的制备 | 第42页 |
| ·转化质粒构建 | 第42页 |
| ·转化一般步骤 | 第42-43页 |
| ·REMI 转化的机制 | 第43页 |
| ·REMI 转化的主要优点 | 第43-44页 |
| ·REMI 转化存在的问题及前景展望 | 第44-45页 |
| ·本课题研究的目的和意义 | 第45-46页 |
| 第二章 材料与方法 | 第46-85页 |
| ·实验材料 | 第46-49页 |
| ·植物材料 | 第46页 |
| ·菌株和载体 | 第46页 |
| ·试剂盒及购买的试剂 | 第46-47页 |
| ·自配溶液试剂 | 第47-49页 |
| ·仪器和设备 | 第49页 |
| ·实验方法 | 第49-85页 |
| ·内生真菌的分离 | 第49-50页 |
| ·发酵培养 | 第50页 |
| ·有机物质的萃取 | 第50页 |
| ·紫杉醇及紫杉烷类物质测定 | 第50-51页 |
| ·样品预处理 | 第50页 |
| ·LC-MS 检测条件 | 第50-51页 |
| ·抗癌活性测验 | 第51页 |
| ·真菌的分类 | 第51页 |
| ·产紫杉醇菌株HMGR 基因的克隆和特征分析 | 第51-60页 |
| ·真菌基因组DNA 的提取 | 第51-52页 |
| ·真菌总RNA 的提取 | 第52-53页 |
| ·准备工作 | 第52页 |
| ·真菌RNA 提取步骤 | 第52-53页 |
| ·产紫杉醇真菌RACE-Ready cDNA 的合成 | 第53-54页 |
| ·本研究中基因克隆所用到的引物 | 第54页 |
| ·BT2HMGR 基因核心片段的克隆 | 第54-55页 |
| ·BT2HMGR 基因3′RACE 和5′RACE | 第55-56页 |
| ·BT2HMGR 基因全长cDNA 的克隆 | 第56页 |
| ·目的条带和酶切产物的纯化回收 | 第56-57页 |
| ·回收片段与pMD18-T 载体的连接 | 第57页 |
| ·氯化钙法制备新鲜大肠杆菌感受态细胞 | 第57-58页 |
| ·连接产物转化感大肠杆菌感受受态细胞 | 第58页 |
| ·质粒小量提取 | 第58-59页 |
| ·阳性克隆的PCR 筛选及测序鉴定 | 第59页 |
| ·BT2HMGR 基因组序列的克隆 | 第59-60页 |
| ·生物信息学分析 | 第60页 |
| ·BT2HMGR 基因组Southern blot 分析 | 第60-64页 |
| ·部分杂交试剂配置 | 第60-61页 |
| ·真菌基因组DNA 的限制性酶切及电泳 | 第61页 |
| ·探针的制备与标记 | 第61页 |
| ·凝胶转膜和固定 | 第61-62页 |
| ·预杂交 | 第62-63页 |
| ·杂交 | 第63页 |
| ·洗膜、封阻和抗体温育 | 第63页 |
| ·压片 | 第63页 |
| ·放射自显影 | 第63-64页 |
| ·基因表达的RT-PCR 分析方法 | 第64页 |
| ·真菌的诱导处理与RNA 提取 | 第64页 |
| ·RT-PCR 分析 | 第64页 |
| ·产紫杉醇内生真菌BT2 原生质体的制备与再生率的测定 | 第64-66页 |
| ·原生质体的记数 | 第66页 |
| ·限制酶介导（REMI）原生质体转化 | 第66-70页 |
| ·质粒DNA 的大量制备 | 第66-67页 |
| ·质粒抽提溶液（I,II,III,IV）配置 | 第66-67页 |
| ·质粒DNA 制备步骤 | 第67页 |
| ·质粒的定量与酶切 | 第67-68页 |
| ·转化 | 第68-69页 |
| ·转化子的鉴定 | 第69-70页 |
| ·PCR 鉴定 | 第69页 |
| ·Southern blot 分析 | 第69-70页 |
| ·产紫杉醇内生真菌代谢工程前期准备工作 | 第70-77页 |
| ·CTAB 法提取蔓地亚红豆杉总的RNA | 第70页 |
| ·RNA 缓冲液配制 | 第70页 |
| ·提取步骤 | 第70页 |
| ·蔓地亚红豆杉cDNA 第一链的合成 | 第70-71页 |
| ·TS，DBTNBT，DBAT 和BAPT 基因编码区的克隆 | 第71-72页 |
| ·真菌表达载体pV2+TS，pV2+DBAT，pV2+BAPT 和pV2+DBTNBT的构建 | 第72-77页 |
| ·中间载体pDC316+HPH 的构建 | 第72-74页 |
| ·中间载体pDC316+DBAT 和pDC316+BAPT 的构建 | 第74-75页 |
| ·中间载体pDC316+TS 和pDC316+DBTNBT 的构建 | 第75-76页 |
| ·pV2+TS，pV2+DBAT，pV2+BAPT 和pV2+DBTNBT 的构建 | 第76-77页 |
| ·山榛中紫杉醇合成途径上相关基因的克隆 | 第77-85页 |
| ·材料准备 | 第77页 |
| ·材料处理 | 第77页 |
| ·山榛总RNA 提取 | 第77页 |
| ·CTAB 法提取山榛基因组DNA | 第77-78页 |
| ·DNA 提取缓冲液的配制 | 第77页 |
| ·DNA 提取步骤 | 第77-78页 |
| ·山榛总RNA 合成第一链cDNA 合成 | 第78页 |
| ·CgHMGR, CgIPI, CgGGPPS 基因的克隆 | 第78-81页 |
| ·CgHMGR, CgIPI, CgGGPPS 基因核心片段的克隆 | 第78-79页 |
| ·本研究中所用到的引物 | 第79-80页 |
| ·3′RACE 实验步骤 | 第80-81页 |
| ·5′RACE 实验步骤 | 第81页 |
| ·CgHMGR, CgIPI, CgGGPPS 全长cDNA 的克隆 | 第81页 |
| ·生物信息学分析 | 第81-82页 |
| ·基因组Southern 杂交分析 | 第82页 |
| ·表达特征分析 | 第82页 |
| ·CgHMGR 和CgIPI 基因的功能验证 | 第82-85页 |
| ·功能验证中用到的质粒：pAC-BETA 和pTrcAtIPI | 第83-84页 |
| ·带有酶切位点的CgHMGR 和CgIPI 编码区的克隆 | 第84页 |
| ·表达载体的构建 | 第84页 |
| ·质粒对大肠杆菌TOP10 F′的转化，建立对照菌株 | 第84-85页 |
| 第三章 红豆杉中产紫杉醇内生真菌的分离及鉴定 | 第85-92页 |
| ·引言 | 第85页 |
| ·结果与分析 | 第85-90页 |
| ·产紫杉醇及其前体内生真菌形态特征及分类 | 第85-87页 |
| ·菌株DF110 生产紫杉醇的检测结果 | 第87-90页 |
| ·菌株DF110 HPLC 的检测 | 第87-88页 |
| ·LC-MS 检测 | 第88-90页 |
| ·抗癌细胞活性检测 | 第90页 |
| ·讨论 | 第90-92页 |
| 第四章 BT2 菌株紫杉醇合成途径上HMGR 基因 | 第92-107页 |
| ·引言 | 第92-93页 |
| ·结果与分析 | 第93-106页 |
| ·BT2 菌株HMGR 基因全长的克隆与特征分析 | 第93-96页 |
| ·BT2HMGR 蛋白的生物信息学分析 | 第96-104页 |
| ·BT2HMGR 基因的Southern blot 分析 | 第104-105页 |
| ·BT2HMGR 基因的表达分析 | 第105-106页 |
| ·小结 | 第106-107页 |
| 第五章 限制酶介导内生真菌遗传转化和分子鉴定 | 第107-113页 |
| ·引言 | 第107-108页 |
| ·结果与分析 | 第108-112页 |
| ·质粒DNA 的检测 | 第108页 |
| ·原生质体的形态及制备的效率 | 第108-109页 |
| ·转化频率及转化子稳定性检测 | 第109-110页 |
| ·转化子的PCR 检测 | 第110-111页 |
| ·转化子的Southern blot 分析 | 第111-112页 |
| ·小结 | 第112-113页 |
| 第六章 红豆杉TS，DBAT，BAPT 和DBTNBT 基因的克隆 | 第113-119页 |
| ·前言 | 第113-114页 |
| ·红豆杉TS，DBAT，BAPT 和DBTNBT 基因的克隆 | 第114-115页 |
| ·中间载体pDC316-HPH 的构建 | 第115页 |
| ·中间载体pDC316+TS, pDC316+BAPT, pDC316+DBAT 和pDC316+DBTNBT 的构建 | 第115-118页 |
| ·真菌表达载体pV2+TS, pV2+BAPT, pV2+DBAT 和pV2+DBTNBT 的构建 | 第118-119页 |
| 第七章 欧洲榛子中紫杉醇合成途径上重要基因的克隆，特征分析及功能验证 | 第119-146页 |
| ·引言 | 第119页 |
| ·结果与分析 | 第119-145页 |
| ·山榛中总RNA 和DNA 的提取 | 第119-120页 |
| ·山榛3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A 还原酶(CgHMGR） | 第120-129页 |
| ·CgHMGR 全长基因的分子克隆 | 第121-123页 |
| ·CgHMGR 的生物信息学分析 | 第123-126页 |
| ·CgHMGR 基因的Southern blot 分析 | 第126页 |
| ·CgHMGR 基因的表达分析 | 第126-127页 |
| ·甲基茉莉酸诱导处理下的CgHMGR 表达特征分析 | 第127-128页 |
| ·CgHMGR 的功能验证 | 第128-129页 |
| ·山榛异戊烯基焦磷酸：二甲基丙烯基焦磷酸异构酶(CgIPI) | 第129-137页 |
| ·山榛IPI 基因全长cDNA 的分子克隆 | 第129-131页 |
| ·CgIPI 的生物信息学分析 | 第131-134页 |
| ·CgIPI 基因的Southern blot 交分析 | 第134-135页 |
| ·CgIPI 基因的表达分析 | 第135-136页 |
| ·CgIPI 的功能验证 | 第136-137页 |
| ·山榛合成紫杉醇骨架的香叶基香叶基焦磷酸合成酶（CgGGPPS） | 第137-145页 |
| ·CgGGPPS 全长基因的分子克隆 | 第137-138页 |
| ·CgGGPPS 生物信息学分析 | 第138-142页 |
| ·CgGGPPS 基因的Southern blot 分析 | 第142-143页 |
| ·CgGGPPS 基因的表达分析 | 第143-144页 |
| ·甲基茉莉酸诱导处理下的 CgGGPPS 表达特征分析 | 第144-145页 |
| ·本章小结 | 第145-146页 |
| 第八章 结论与展望 | 第146-149页 |
| ·研究结论 | 第146-147页 |
| ·本研究的主要创新之处 | 第147-148页 |
| ·后续研究方向 | 第148-149页 |
| 参考文献 | 第149-165页 |
| 缩写词表 | 第165-167页 |
| 致 谢 | 第167-168页 |
| 攻读博士学位期间发表、拟发表的论文 | 第168-169页 |
