| 中文摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-9页 |
| 符号说明 | 第9-13页 |
| 第一章 文献综述 | 第13-25页 |
| 1. 猪繁殖与呼吸综合征研究进展 | 第13-21页 |
| ·PRRSV概述 | 第13页 |
| ·PRRSV病毒学特性 | 第13-14页 |
| ·病毒基因组结构 | 第14-15页 |
| ·PRRSV主要结构蛋白 | 第15-16页 |
| ·PRRSV的检测与诊断方法 | 第16-18页 |
| ·病毒分离 | 第16-17页 |
| ·PRRSV抗原检测技术 | 第17-18页 |
| ·PRRSV抗体检测技术 | 第18页 |
| ·PRRS疫苗的研制 | 第18-21页 |
| ·常规疫苗 | 第18-19页 |
| ·基因疫苗 | 第19-20页 |
| ·活载体疫苗 | 第20页 |
| ·亚单位疫苗 | 第20-21页 |
| 2. 热休克蛋白70研究进展 | 第21-23页 |
| ·热休克蛋白概述 | 第21页 |
| ·Hsp70的结构及特点 | 第21页 |
| ·Hsp70的生物学功能 | 第21-23页 |
| ·分子伴侣功能 | 第21-22页 |
| ·耐热性功能 | 第22页 |
| ·介导蛋白跨膜转运 | 第22页 |
| ·增强免疫反应功能 | 第22-23页 |
| 3 研究目的与意义 | 第23-25页 |
| 第二章 核酸疫苗pCI-ORF5-ORF6A与pCI-ORF5-ORF6B-Hsp70的构建及小鼠免疫研究 | 第25-63页 |
| 1. 实验材料 | 第25-28页 |
| ·质粒、菌株与细胞 | 第25页 |
| ·主要试剂 | 第25页 |
| ·溶液的配制 | 第25-28页 |
| ·主要仪器 | 第28页 |
| 2 方法 | 第28-49页 |
| ·重组表达质粒pCI-ORF5-ORF6A和pCI-ORF5-ORF6B-Hsp70的构建与鉴定 | 第28-39页 |
| ·引物设计与合成 | 第28-29页 |
| ·重组表达质粒pCI-ORF5-ORF6A和pCI-ORF5-ORF6B-Hsp70的构建图 | 第29页 |
| ·表达目的基因片段ORF5、ORF6(6A、6B)、Hsp70的克隆 | 第29-35页 |
| ·pMD19-T-ORF5-ORF6重组质粒的构建 | 第35-37页 |
| ·真核表达载体pCI-ORF5-ORF6A的构建 | 第37-38页 |
| ·真核表达载体pCI-ORF5-ORF6B-Hsp70的构建 | 第38-39页 |
| ·质粒转染及表达产物的检测 | 第39-44页 |
| ·质粒pCI-ORF5-ORF6A与pCI-ORF5-ORF6B-Hsp70 DNA的小量抽提与纯化 | 第39-41页 |
| ·质粒DNA的转染 | 第41页 |
| ·表达产物的间接免疫荧光试验(IFA) | 第41-42页 |
| ·融合蛋白表达产物免疫印迹分析(Western-blotting) | 第42-44页 |
| ·重组质粒的免疫原性研究 | 第44-49页 |
| ·重组质粒DNA的大量制备及纯化 | 第44-45页 |
| ·质粒DNA动物免疫 | 第45页 |
| ·淋巴细胞转化实验 | 第45-46页 |
| ·CD~(4+)、CD~(8+)T细胞亚群数量检测 | 第46-47页 |
| ·IL-4和IFN-γ细胞因子检测 | 第47-48页 |
| ·小鼠血清中和抗体检测 | 第48-49页 |
| 3. 试验结果 | 第49-59页 |
| ·表达目的基因片段ORF5、ORF6(6A、6B)、Hsp70的克隆 | 第49-51页 |
| ·PRRSV ORF5、ORF6基因及Hsp70基因的PCR扩增 | 第49-50页 |
| ·pMD19-T-ORF5、pMD19-T-ORF6A、pMD19-T-ORF6B和pMD19-T-Hsp70质粒的酶切鉴定 | 第50-51页 |
| ·序列测定 | 第51页 |
| ·串联融合表达基因的连接 | 第51-52页 |
| ·pMD19-T-ORF5-ORF6A、pMD19-T-ORF5-ORF6B质粒的酶切鉴定 | 第51-52页 |
| ·序列测定 | 第52页 |
| ·pCI-ORF5-ORF6A、pCI-ORF5-ORF6B-Hsp70真核表达载体构建 | 第52-53页 |
| ·pCI-ORF5-ORF6A、pCI-ORF5-ORF6B-Hsp70质粒的酶切鉴定 | 第52-53页 |
| ·重组质粒在COS-7细胞中的表达 | 第53-55页 |
| ·IFA检测 | 第53-54页 |
| ·Western-blotting检测 | 第54-55页 |
| ·重组质粒的免疫原性研究 | 第55-59页 |
| ·淋巴细胞转化实验 | 第55页 |
| ·脾T-淋巴细胞亚群数量检测 | 第55-56页 |
| ·IL-4和IFN-γ细胞因子检测 | 第56-57页 |
| ·中和抗体检测结果 | 第57-59页 |
| 4. 讨论 | 第59-63页 |
| ·外源基因的选择 | 第59-60页 |
| ·真核重组表达载体的选择 | 第60页 |
| ·真核重组表达质粒表达外源基因水平的讨论 | 第60-61页 |
| ·Hsp70与ORF5、ORF6基因融合表达PRRSV核酸疫苗诱导的免疫反应 | 第61-63页 |
| 全文小结 | 第63-64页 |
| 参考文献 | 第64-71页 |
| 致谢 | 第71-72页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 | 第72页 |
