| 摘要 | 第1-18页 |
| Abatract | 第18-27页 |
| 符号说明 | 第27-30页 |
| 前言 | 第30-36页 |
| 总体设计方案及研究程序 | 第36-38页 |
| 第一部分针对于hTERT启动子调控区关键区段的反义寡核苷酸体内、外抑制肝癌细胞生长的研究 | 第38-51页 |
| 第一部分技术路线 | 第39-40页 |
| 材料与方法 | 第40-42页 |
| 1.材料 | 第40页 |
| 2.方法 | 第40-42页 |
| ·体外研究 | 第40-41页 |
| ·细胞培养 | 第40页 |
| ·生长抑制实验(MTT法)： | 第40-41页 |
| ·PCR-ELISA定量检测端粒酶活性 | 第41页 |
| ·体内研究 | 第41-42页 |
| ·裸鼠接种 | 第41页 |
| ·as-hTERT体内抑制瘤细胞生长实验 | 第41-42页 |
| ·as-hTERT对病毒抗原表达的影响 | 第42页 |
| ·统计分析 | 第42页 |
| 结果 | 第42-44页 |
| 1 as-hTERT体外抑瘤效应 | 第42-43页 |
| ·有效抑制HepG2.2.15细胞生长 | 第42页 |
| ·有效降低肝癌细胞端粒酶活性 | 第42-43页 |
| 2 as-hTERT体内抑瘤效应 | 第43-44页 |
| ·瘤内用药抑制瘤细胞生长现象 | 第43-44页 |
| 3 hTERT基因区反义核酸可影响HBV抗原表达 | 第44页 |
| 4 毒性实验结果 | 第44页 |
| 讨论 | 第44-47页 |
| 小结 | 第47-48页 |
| 第一部分附图 | 第48-51页 |
| 第二部分 参与肿瘤发生相关位点的反义RNA细菌内同源重组型腺病毒表达载体的构建及对肝癌细胞抑制效应研究 | 第51-151页 |
| 技术路线及主要研究内容 | 第52-53页 |
| 第一节 参与肿瘤发生相关位点的反义RNA细菌内同源重组型腺病毒基因组载体的构建 | 第53-87页 |
| 材料与方法 | 第54-73页 |
| 1.材料 | 第54-60页 |
| ·细菌内同源重组型腺病毒表达载体系统 | 第54-56页 |
| ·相关质粒与工程菌 | 第56-60页 |
| 2.方法 | 第60-73页 |
| ·hTERT调控区各基因区段的腺病毒穿梭载体的构建 | 第61-69页 |
| ·质粒DNA的制备 | 第61-64页 |
| ·质粒pCR-TRTP的小量制备 | 第61-62页 |
| ·质粒pCR-TRTP的小量酶切鉴定 | 第62页 |
| ·质粒pShuttle-CMV、pAdTrack-CMV的小量酶切鉴定 | 第62页 |
| ·QIAprep Spin miniprep试剂盒提取与纯化质粒DNA | 第62-64页 |
| ·构建hTERT调控区HBV preS2整合位点(hS2)的反义腺病毒穿梭载体 | 第64-68页 |
| ·PCR扩增目的片段 | 第64页 |
| ·目的基因hS2的大量酶切 | 第64-65页 |
| ·目的基因hS2的回收与纯化 | 第65-66页 |
| ·穿梭载体pAdTrack-CMV的酶切线性化 | 第66页 |
| ·线性化pAdTrack-CMV的回收 | 第66页 |
| ·目的基因hS2与载体的连接与转化 | 第66-67页 |
| ·目的基因与载体的连接 | 第66页 |
| ·感受态细菌的制备 | 第66-67页 |
| ·重组质粒的转化 | 第67页 |
| ·阳性重组子的筛选鉴定 | 第67-68页 |
| ·重组子的酶切筛选 | 第67-68页 |
| ·PCR鉴定连接的方向 | 第68页 |
| ·DNA自动测序与序列分析 | 第68页 |
| ·构建hTERT调控区c-Myc结合位点(hmyc)的腺病毒反义穿梭载体 | 第68页 |
| ·构建hTERT启动子活性区的腺病毒穿梭载体 | 第68页 |
| ·阳性克隆的保存 | 第68-69页 |
| ·细菌内同源重组构建hTERT调控区各基因区段的腺病毒表达载体 | 第69-73页 |
| ·骨架质粒pAdEasy-1的制备 | 第69页 |
| ·HBV preS2同源序列的腺病毒反义基因组载体的同源重组 | 第69-72页 |
| ·pTrack-ashS2质粒的抽提与纯化 | 第69页 |
| ·pTrack-ashS2质粒的线性化与回收 | 第69-70页 |
| ·电穿孔感受态细菌的制备 | 第70页 |
| ·线性化pTrack-ashS2与骨架质粒pAdEasy-1的共转化——电穿孔法 | 第70-71页 |
| ·转化子的筛选鉴定 | 第71-72页 |
| ·c-Myc结合位点的反义腺病毒表达载体的同源重组 | 第72页 |
| ·hTERT调控区大片段腺病毒正、反义表达载体的同源重组 | 第72页 |
| ·对照载体的同源重组——CaCl_2法 | 第72-73页 |
| ·感受态细菌(AdEasier-1细胞)的制备 | 第73页 |
| ·线性化pAdTrack—CMV的转化 | 第73页 |
| ·转化子的筛选鉴定 | 第73页 |
| ·阳性克隆的保存 | 第73页 |
| 结果 | 第73-79页 |
| 1 质粒pCR-TRTP的鉴定 | 第73-74页 |
| 2 hTERT调控区各基因区段的腺病毒穿梭载体的构建 | 第74-77页 |
| ·反义RNA腺病毒穿梭载体pAdTrack-ashS2的构建 | 第74-75页 |
| ·反义RNA腺病毒穿梭载体pCMV-ashmyc的构建 | 第75-76页 |
| ·目的基因hmyc的获得 | 第75页 |
| ·目的基因hmyc和载体的酶切回收 | 第75页 |
| ·阳性重组子的酶切筛选 | 第75-76页 |
| ·阳性重组子的PCR鉴定 | 第76页 |
| ·DNA测序及序列分析 | 第76页 |
| ·反义、正义RNA腺病毒穿梭载体pCMV-ashTERT、pCMV-shTERT的构建 | 第76-77页 |
| 3 细菌内同源重组 | 第77-79页 |
| ·骨架质粒的获得 | 第77页 |
| ·反义RNA腺病毒表达载体pAdEasy-ashS2的同源重组 | 第77-78页 |
| ·反义RNA腺病毒表达载体pAdEasy-ashmyc的同源重组 | 第78页 |
| ·正反义RNA腺病毒表达载体pAdEasy-shTERT／pAdEasy-ashTERT的同源重组 | 第78-79页 |
| ·空载体pAdEasy-Track的同源重组 | 第79页 |
| 讨论 | 第79-87页 |
| 第二节 293细胞内产生腺病毒及病毒滴度滴定 | 第87-99页 |
| 材料与方法 | 第87-93页 |
| 1.材料 | 第87-88页 |
| 2.方法 | 第88-93页 |
| ·大量扩增、纯化阳性重组子DNA | 第88页 |
| ·腺病毒表达质粒的线性化 | 第88-89页 |
| ·腺病毒的包装 | 第89-91页 |
| ·腺病毒滴度滴定 | 第91-93页 |
| 结果 | 第93-94页 |
| 1.线性化质粒DNA的鉴定 | 第93页 |
| 2.线性化质粒DNA的回收 | 第93页 |
| 3.腺病毒穿梭载体转染293细胞 | 第93-94页 |
| 4.病毒的纯化与滴度滴定 | 第94页 |
| 讨论 | 第94-99页 |
| 第三节 hTERT反义RNA体内、外抑制肝癌细胞生长的研究 | 第99-127页 |
| 材料与方法 | 第99-110页 |
| 1.材料 | 第99-100页 |
| 2.方法 | 第100-110页 |
| ·HepG2.2.15细胞的培养 | 第100-101页 |
| ·hTERT调控区HBV整合位点的反义RNA对肝癌细胞的体外抑制实验 | 第101-107页 |
| ·腺病毒pAd-ashS2体外转染肝癌细胞 | 第101页 |
| ·MTT法检测腺病毒对细胞生长代谢的影响 | 第101页 |
| ·流式细胞术进行细胞周期分析 | 第101-102页 |
| ·Annexin V-FITC／PI双染检测早期细胞凋亡 | 第102页 |
| ·TRAP-PCR—ELISA检测细胞端粒酶活性 | 第102-104页 |
| ·聚丙烯酰氨凝胶电泳检测细胞端粒酶活性 | 第104页 |
| ·RT-PCR检测反义RNA对端粒酶蛋白表达的抑制作用 | 第104-107页 |
| ·hTERT调控区mye结合位点、长序列调控区的反义RNA对肝癌细胞的体外抑制实验 | 第107-108页 |
| ·MTT法检测腺病毒对细胞生长代谢的影响 | 第107页 |
| ·细胞凋亡分析 | 第107-108页 |
| ·细胞端粒酶分析 | 第108页 |
| ·hTERT反义RNA对人肝癌荷瘤鼠移植瘤的抑制作用 | 第108-109页 |
| ·人肝癌细胞移植瘤裸鼠模型的制备 | 第108页 |
| ·hTERT反义RNA对裸鼠体内肝癌移植瘤的抑制作用研究 | 第108-109页 |
| ·ELISA检测反义RNA对HBV抗原表达的影响 | 第109页 |
| ·联合封闭癌基因c-Myc基因表达与c—Myc结合位点对肝癌细胞的体外抑制实验 | 第109页 |
| ·同时封闭致瘤病毒HBV preS2基因表达与hTERT调控区同源序列对肝癌细胞的体外抑制实验 | 第109-110页 |
| 结果 | 第110-119页 |
| 1.体外研究 | 第110-114页 |
| ·互补于hTERT启动子调控区关键区段的的反义RNA显著抑制肝癌细胞的生长 | 第110-112页 |
| ·反义封闭关键位点有效降低肝癌细胞端粒酶活性 | 第112-113页 |
| ·反义封闭关键位点增强诱导肝癌细胞凋亡效应 | 第113页 |
| ·反义封闭关键位点可影响HBV抗原表达 | 第113-114页 |
| ·构建的反义RNA腺病毒可高效率感染肝癌细胞 | 第114页 |
| 2.反义RNA腺病毒对裸鼠肝癌移植瘤的抑制作用 | 第114-117页 |
| 3 联合封闭癌基因c-Myc基因表达与c-Myc结合位点对肝癌细胞的体外抑制效应 | 第117页 |
| 4.同时封闭致瘤病毒HBV preS2基因表达与hTERT调控区同源序列对肝癌细胞的体外抑制作用 | 第117-119页 |
| 讨论 | 第119-126页 |
| 小结 | 第126-127页 |
| 第二部分附图 | 第127-151页 |
| 参考文献 | 第151-168页 |
| 致谢 | 第168-169页 |
| 发表论文与专著 | 第169-172页 |
