| 目录 | 第1-7页 |
| 缩略词 | 第7-8页 |
| 摘要 | 第8-9页 |
| 英文摘要 | 第9-11页 |
| 一、 前言 | 第11-14页 |
| 二、 材料和方法 | 第14-42页 |
| 1 材料与试剂 | 第14-16页 |
| ·菌种和质粒 | 第14页 |
| ·常用酶和生化试剂 | 第14-16页 |
| ·分子生物学常用酶及试剂盒 | 第14-15页 |
| ·分子生物学常用生化试剂 | 第15-16页 |
| ·植物材料 | 第16页 |
| ·主要仪器设备 | 第16页 |
| 2 方法 | 第16-42页 |
| ·基因组DNA的制备 | 第16-17页 |
| ·基因组DNA的提取-碱法提取Ys1中的基因组DNA | 第16-17页 |
| ·1％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度及浓度 | 第17页 |
| ·引物的设计与基因的扩增 | 第17-18页 |
| ·引物的设计 | 第17-18页 |
| ·PCR扩增YS1中phaC1、phaC2基因 | 第18页 |
| ·phaC1、phaC2基因的克隆与测序 | 第18-22页 |
| ·phaC1、phaC2基因目的片段的回收 | 第19页 |
| ·PCR回收产物与T-载体连接 | 第19-20页 |
| ·E.coli DH_(5α)感受态细胞的制备 | 第20页 |
| ·连接产物的转化 | 第20页 |
| ·重组质粒的酶切鉴定 | 第20-22页 |
| ·重组质粒的提取 | 第20-21页 |
| ·重组质粒的纯化 | 第21-22页 |
| ·重组质粒的酶切鉴定 | 第22页 |
| ·序列测定 | 第22页 |
| ·phaC1 phaC2基因亚克隆 | 第22-24页 |
| ·亚克隆引物设计 | 第22-23页 |
| ·大量提取纯化pGEM-TC1，pGEM-TC2质粒 | 第23页 |
| ·PCR扩增调SC1、SC2 | 第23-24页 |
| ·目的片段回收 | 第24页 |
| ·PCR回收产物与T-载体连接、转化及鉴定 | 第24页 |
| ·测序 | 第24页 |
| ·phaC1基因的定点突变 | 第24-26页 |
| ·phaC1定点突变引物的设计 | 第24页 |
| ·套叠PCR扩增定点突变PstⅠ位点 | 第24-25页 |
| ·回收目的片段、连接、转化及鉴定 | 第25页 |
| ·用SphⅠ酶切pGEM-TClP质粒定向 | 第25-26页 |
| ·测序鉴定 | 第26页 |
| ·phaC1、phaC2基因单价载体的构建 | 第26-27页 |
| ·用BamHⅠ和SacⅠ双酶切切下目的片段phaC1、phaC2 | 第26页 |
| ·目的片段phaC1、phaC2分别连接到表达载体pC3上 | 第26-27页 |
| ·连接产物pC3C1、pC3C2转化E.coli DH5a | 第27页 |
| ·质粒提取、纯化及酶切鉴定 | 第27页 |
| ·嵌合phaC1、phaC2基因的双价表达载体的构建 | 第27-31页 |
| ·用PstⅠ和HindⅢ从pC3C1质粒上双酶切切下目的片段 | 第27-29页 |
| ·酶切 | 第27-28页 |
| ·补平 | 第28页 |
| ·用HindⅢ进行酶切反应 | 第28页 |
| ·1.2％琼脂糖电泳检测，回收含启动子的目的片段 | 第28-29页 |
| ·用EcoRⅠ和HindⅢ从pC3C2质粒上双酶切切下目的片段 | 第29-30页 |
| ·酶切 | 第29页 |
| ·补平 | 第29-30页 |
| ·用HindⅢ进行酶切回收 | 第30页 |
| ·双价表达载体的构建 | 第30-31页 |
| ·目的片段的连接 | 第30页 |
| ·连接产物pC3C1C2转化E.coli DH5a | 第30页 |
| ·质粒提取纯化及其PCR鉴定双价基因 | 第30-31页 |
| ·农杆菌工程菌的构建 | 第31-35页 |
| ·农杆菌感受态的制备 | 第31页 |
| ·双价载体pC3C1C2转化农杆菌EHA105 | 第31页 |
| ·农杆菌质粒的提取 | 第31-32页 |
| ·PCR鉴定农杆菌中的双价载体pC3C1C2 | 第32页 |
| ·探针的标记 | 第32-33页 |
| ·酶切 | 第32-33页 |
| ·探针标记 | 第33页 |
| ·斑点杂交检测 | 第33-35页 |
| ·斑点杂交所需试剂的配制 | 第33-34页 |
| ·烘膜、杂交 | 第34页 |
| ·洗膜 | 第34页 |
| ·底物反应 | 第34-35页 |
| ·植物基因转化 | 第35-36页 |
| ·无菌烟草试管苗 | 第35页 |
| ·利用叶盘法转化烟草 | 第35-36页 |
| ·农杆菌侵染液的制备 | 第35页 |
| ·侵染 | 第35-36页 |
| ·抗性愈伤组织筛选诱导出芽 | 第36页 |
| ·壮苗 | 第36页 |
| ·转化植株的诱根培养 | 第36页 |
| ·卡那抗性植株移栽 | 第36页 |
| ·转化烟草植株的鉴定 | 第36-40页 |
| ·烟草总DNA的提取(改良CTAB法) | 第36-37页 |
| ·PCR-southern鉴定转基因植株 | 第37-39页 |
| ·PCR鉴定转基因植株 | 第37-38页 |
| ·PCR-southern检测 | 第38-39页 |
| ·卡那霉素抗性再筛选鉴定转化植株 | 第39页 |
| ·取转化植株外植体卡那霉素抗性再筛选诱导出芽法鉴定 | 第39页 |
| ·卡那霉素抗性大田直接筛选转化植株 | 第39页 |
| ·Southern Blot检测 | 第39-40页 |
| ·转基因植株的产物检测 | 第40-42页 |
| ·PHA的提取纯化 | 第40-41页 |
| ·傅立叶变换红外检测(FT-IR) | 第41页 |
| ·气相色谱(GC) | 第41-42页 |
| 三、 结果与分析 | 第42-57页 |
| ·碱法提取Ys1中的基因组DNA | 第42页 |
| ·phaC1、phaC2基因的克隆 | 第42-45页 |
| ·用套叠PCR突变phaC1基因中PstⅠ位点 | 第45-47页 |
| ·phaC1和phaC2基因单价中间载体pC3C1和pC3C2的构建 | 第47-48页 |
| ·嵌合phaC1、phaC2基因双价表达载体pC3C1C2的构建 | 第48-49页 |
| ·农杆菌工程菌株的构建 | 第49-51页 |
| ·农杆菌叶盘法转化烟草 | 第51-52页 |
| ·农杆菌的浸染与共培养 | 第51页 |
| ·抗性愈伤组织的的筛选诱导不定芽，获取转化植株 | 第51-52页 |
| ·转化植株的检测 | 第52-57页 |
| ·PCR、PCR-Southern blot检测转化植株 | 第52-53页 |
| ·Kan再筛选鉴定转化植株 | 第53页 |
| ·Southern blot检测转化植株 | 第53-54页 |
| ·从植物中抽提、纯化PHAs | 第54-55页 |
| ·傅立叶红外检测PHAs | 第55-56页 |
| ·气象色谱检测PHAs的含量 | 第56-57页 |
| 四、 讨论 | 第57-62页 |
| 1 、 关于PHA合成酶基因 | 第57-58页 |
| 2 、 关于PHA双价表达载体 | 第58-59页 |
| 3 、 关于利用转基因植物生产PHAs | 第59-62页 |
| 五、 结论 | 第62-63页 |
| 文献综述 | 第63-71页 |
| 参考文献 | 第71-77页 |
| 附图 | 第77-90页 |
| 附录 | 第90-94页 |
