| 中文摘要 | 第1-10页 |
| 英文摘要 | 第10-14页 |
| 一.前言 | 第14-22页 |
| 1.信息传递和调控 | 第14-16页 |
| 2.功能基因组研究 | 第16-17页 |
| 3.DNA与蛋白质之间的相互作用和转录调节 | 第17-19页 |
| 4.DNA调节元件和DNA结合蛋白筛选、鉴定 | 第19-20页 |
| 5.本实验室以前的工作和本论文的基本内容 | 第20-22页 |
| 二.材料与方法 | 第22-49页 |
| (一) 实验材料 | 第22-27页 |
| 1.菌株与细胞系 | 第22页 |
| 2.质粒载体 | 第22-25页 |
| 3.培养基 | 第25页 |
| 4.限制性内切酶及修饰酶 | 第25页 |
| 5.寡核苷酸 | 第25页 |
| 6.试剂盒 | 第25页 |
| 7.放射性核素 | 第25页 |
| 8.其它主要试剂 | 第25页 |
| 9.cDNA文库 | 第25页 |
| 10.主要仪器设备 | 第25-26页 |
| 11.溶液配制 | 第26-27页 |
| (二) 实验方法 | 第27-49页 |
| 1.实验基本技术路线图 | 第27-28页 |
| 2.人apoA_1C_3A_4基因簇的BAC DNA制备、纯化与酶切回收 | 第28-29页 |
| ·BAC DNA的大量制备 | 第28-29页 |
| ·BAC DNA的超离纯化 | 第29页 |
| ·脉冲场凝胶电泳(PFGE)回收纯化酶切片段 | 第29页 |
| 3.BAC小片段探针的制备 | 第29-32页 |
| ·超声打断BAC大片段DNA | 第29-30页 |
| ·小片段DNA的削平与补平 | 第30页 |
| ·DNA片段的纯化 | 第30页 |
| ·Oligo E的磷酸化和DNA连接子的形成 | 第30页 |
| ·连接反应 | 第30-31页 |
| ·PCR扩增 | 第31页 |
| ·第一轮凝胶阻滞实验用的人BAC DNA探针的制备 | 第31-32页 |
| 4.细胞核粗提物的制备 | 第32-33页 |
| ·细胞复苏与培养 | 第32页 |
| ·细胞冻存 | 第32页 |
| ·核粗提物的制备 | 第32-33页 |
| ·蛋白定量 | 第33页 |
| 5.多轮聚丙烯酰胺凝胶阻滞法富集调节片段 | 第33-34页 |
| ·EMSA | 第33页 |
| ·DNA探针与hepG2细胞核粗提物的第二至五轮EMSA实验 | 第33-34页 |
| ·富集后调节片段的PCR大量扩增与回收纯化 | 第34页 |
| 6.DNA调节片段质粒文库的构建 | 第34-36页 |
| ·调节片段的酶切消化 | 第34-35页 |
| ·质粒PUC19的限制性消化 | 第35页 |
| ·载体DNA的去磷酸化处理 | 第35页 |
| ·富含调节元件的人BAC DNA与PUC19载体DNA的连接 | 第35-36页 |
| ·自身连接产物和目的片段多拷贝插入的连接产物的去除 | 第36页 |
| ·DH5a感受态细胞的制备与转化 | 第36页 |
| 7.DNA调节片段的EMSA筛选 | 第36-38页 |
| ·单菌落的培养、菌种保存和质粒DNA的小量制备 | 第36-37页 |
| ·质粒DNA的酶切鉴定 | 第37页 |
| ·插入调节片段的回收 | 第37页 |
| ·调节片段的同位素标记 | 第37页 |
| ·调节片段的EMSA筛选 | 第37-38页 |
| 8.DNA调节片段的初步分析 | 第38页 |
| ·DNA调节片段的测序 | 第38页 |
| ·BLAST同源性分析 | 第38页 |
| ·DNA上潜在反式作用因子结合位点的分析 | 第38页 |
| 9.荧光素酶报告基因真核表达质粒的瞬时表达及其酶活性的测定 | 第38-41页 |
| ·调节片段-荧光素酶报告基因重组质粒的构建 | 第38-40页 |
| ·重组质粒的鉴定和纯化 | 第40页 |
| ·Lipofectamine 2000法转染真核细胞 | 第40-41页 |
| ·转染细胞的裂解 | 第41页 |
| ·荧光强度的检测 | 第41页 |
| ·用分光光度法测定β-半乳糖苷酶活性 | 第41页 |
| 10.利用酵母单杂交体系筛选DNA结合蛋白 | 第41-49页 |
| ·质粒文库滴度的测定 | 第41-42页 |
| ·质粒文库的扩增 | 第42页 |
| ·酵母菌株的表型验证、保存及培养 | 第42-43页 |
| ·制备酵母感受态细胞 | 第43页 |
| ·调节片段-His报告基因重组质粒的构建与鉴定 | 第43-45页 |
| ·报告基因载体整合到酵母基因组中 | 第45-46页 |
| ·整合有靶序列-His报告基因重组体的菌株的背景表达检测 | 第46页 |
| ·cDNA文库的转化及克隆筛选 | 第46-48页 |
| ·阳性克隆插入片段序列的PCR扩增鉴定 | 第48页 |
| ·阳性克隆插入片段的序列测定 | 第48页 |
| ·核酸序列的计算机分析 | 第48-49页 |
| 三.实验结果 | 第49-77页 |
| (一) 人apoA_1C_3A_4基因簇BAC DNA小片段探针制备与调节片段富集 | 第49-51页 |
| 1 脉冲场凝胶电泳(PFGE)回收纯化BAC DNA酶切片段 | 第49页 |
| 2 超声打断BAC大片段DNA | 第49页 |
| 3 PCR扩增与切胶回收 | 第49-51页 |
| 4 DNA探针与hepG2细胞核粗提物的五轮凝胶阻滞实验 | 第51页 |
| (二) DNA调节片段的EMSA筛选与初步分析 | 第51-61页 |
| 1 质粒DNA的酶切鉴定 | 第51-52页 |
| 2 插入片段的EMSA筛选 | 第52-54页 |
| 3 DNA调节片段的测序 | 第54-57页 |
| 4 BLAST同源性分析 | 第57-58页 |
| 5 DNA上潜在反式作用因子结合位点的分析 | 第58-61页 |
| (三) 荧光素酶报告基因重组质粒的瞬时表达 | 第61-67页 |
| 1 重组质粒的酶切鉴定 | 第61页 |
| 2 BAC调节片段转染hepG2细胞的检测结果 | 第61-63页 |
| 3 人基因组调节片段转染K562细胞的检测结果 | 第63-64页 |
| 4 人基因组调节片段转染hepG2细胞的检测结果 | 第64-67页 |
| (四) 利用酵母单杂交体系进行cDNA文库筛选 | 第67-77页 |
| 1 重组质粒的酶切鉴定 | 第67页 |
| 2 将靶DNA序列-报告基因质粒整合到酵母菌株基因组中 | 第67-68页 |
| 3 靶DNA序列-报告基因菌株背景表达的检测 | 第68-69页 |
| 4 人肝MATCHMAKER cDNA文库的滴度测定和扩增 | 第69-70页 |
| 5 利用报告基因菌株对人肝cDNA文库进行筛选 | 第70页 |
| 6 相同克隆的排除与假阳性克隆的排除 | 第70-71页 |
| 7 阳性克隆质粒的插入片段序列测定及同源性比较分析 | 第71-77页 |
| 四.讨论 | 第77-85页 |
| (一) EMSA筛选与一般分析的讨论 | 第77-79页 |
| 1.利用凝胶阻滞实验筛选DNA调节片段的的基本原理 | 第77页 |
| 2.本研究的基本结果与本方法的基本特点 | 第77-78页 |
| 3.已定位的序列 | 第78页 |
| 4.本筛选结果的不足之处与改进 | 第78-79页 |
| (二) 瞬时转染结果讨论 | 第79-80页 |
| 1.本部分基本结果分析 | 第79-80页 |
| 2.E25片段分析 | 第80页 |
| 3.本方法局限性与改进措施 | 第80页 |
| (三) 酵母单杂交结果讨论 | 第80-82页 |
| 1.酵母单杂交系统工作原理 | 第81页 |
| 2.本部分基本结果 | 第81-82页 |
| 3.本方法局限性与改进措施 | 第82页 |
| (四) 本方法综合分析与展望 | 第82-85页 |
| 1.非编码序列与功能基因组研究 | 第82-83页 |
| 2.本方法与基因调控信息传递网络 | 第83-85页 |
| 五.小结 | 第85-86页 |
| 六.参考文献 | 第86-92页 |
| 七.综述 | 第92-108页 |
| (一) 基因组的进化与调控 | 第92-99页 |
| (二) 功能基因组研究中的网络模型构建 | 第99-108页 |
| 八.英文名词及缩写 | 第108-112页 |
| 九 致谢 | 第112-113页 |
| 十 个人简历 | 第113页 |
