| 中文摘要 | 第1-11页 |
| ABSTRACT | 第11-12页 |
| 第一章 文献综述 | 第12-34页 |
| 1 几丁质酶的研究进展 | 第13-24页 |
| ·几丁质的结构 | 第13页 |
| ·几丁质的降解方式 | 第13-14页 |
| ·几丁质酶的研究历史和现状 | 第14-16页 |
| ·几丁质酶的分类和关系 | 第16-17页 |
| ·几丁质酶的抗病作用 | 第17-19页 |
| ·微生物几丁质酶的分子生物学 | 第19-23页 |
| ·信号肽序列 | 第20页 |
| ·催化域 | 第20-22页 |
| ·几丁质结合区域 | 第22-23页 |
| ·C 端序列 | 第23页 |
| ·几丁质酶的应用 | 第23-24页 |
| 2 巴斯德毕赤酵母表达系统的研究进展 | 第24-32页 |
| ·巴斯德毕赤酵母的特性 | 第25-26页 |
| ·毕赤酵母宿主菌和表达载体的类型 | 第26-29页 |
| ·表达载体在毕赤酵母中的整合 | 第29-31页 |
| ·巴斯德毕赤酵母中信号肽的剪切过程 | 第31页 |
| ·巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白展望 | 第31-32页 |
| 3 本研究的目的意义及研究内容 | 第32-34页 |
| ·本研究的目的意义 | 第32-33页 |
| ·研究内容 | 第33-34页 |
| 第二章 嗜热子囊菌光孢变种几丁质酶基因克隆及序列分析 | 第34-65页 |
| 1 材料和方法 | 第34-50页 |
| ·实验材料 | 第34-37页 |
| ·菌株与质粒 | 第34页 |
| ·酶和生化试剂 | 第34-35页 |
| ·仪器 | 第35页 |
| ·培养基 | 第35页 |
| ·溶液配制 | 第35-36页 |
| ·PCR 引物 | 第36-37页 |
| ·实验方法 | 第37-50页 |
| ·总RNA 的提取（Trizol 法） | 第37-38页 |
| ·紫外检测RNA 产率和纯度 | 第38页 |
| ·反转录cDNA 第一链的合成 | 第38-39页 |
| ·目的基因3’末端的分离（3’-RACE） | 第39-45页 |
| ·目的基因3’末端的扩增 | 第39页 |
| ·PCR 产物回收 | 第39-40页 |
| ·载体连接 | 第40-41页 |
| ·大肠杆菌 E.coli 感受态细胞的制备和转化 | 第41-43页 |
| ·大肠杆菌感受态的制备 | 第41-42页 |
| ·大肠杆菌感受态的转化 | 第42-43页 |
| ·重组质粒的筛选与鉴定 | 第43-45页 |
| ·IPTG-X-gal 筛选 | 第43页 |
| ·菌落 PCR 检测 | 第43页 |
| ·碱法小量提取质粒 DNA | 第43-44页 |
| ·质粒 DNA 的酶切鉴定 | 第44页 |
| ·序列测定 | 第44-45页 |
| ·目的基因5’末端的分离（5’-RACE） | 第45-49页 |
| ·cDNA 第一链的合成 | 第45-46页 |
| ·cDNA 第一链的纯化 | 第46-47页 |
| ·cDNA 第一链的加尾 | 第47页 |
| ·RACE-PCR 扩增 | 第47-49页 |
| ·二次 PCR（巢式PCR） | 第49页 |
| ·目的基因全长cDNA 的克隆 | 第49-50页 |
| ·全长序列的生物信息学分析 | 第50页 |
| 2 结果与分析 | 第50-61页 |
| ·嗜热子囊菌光孢变种总RNA 的提取 | 第50页 |
| ·嗜热子囊菌光孢变种几丁质酶基因cDNA3’-末端的分离 | 第50-52页 |
| ·嗜热子囊菌光孢变种几丁质酶基因cDNA 5’-末端的分离 | 第52页 |
| ·嗜热子囊菌光孢变种几丁质酶基因全长cDNA 的分离 | 第52-54页 |
| ·嗜热子囊菌光孢变种几丁质酶基因的核苷酸序列和氨基酸序列分析 | 第54-61页 |
| ·几丁质酶基因Tachit 的核苷酸序列分析 | 第56页 |
| ·几丁质酶基因 Tachit 的预测蛋白氨基酸序列分析 | 第56-59页 |
| ·几丁质酶基因Tachit 的预测蛋白氨基酸组成 | 第59-61页 |
| 3 讨论 | 第61-65页 |
| ·几丁质酶基因克隆的策略 | 第61-62页 |
| ·RACE 技术应注意的问题 | 第62-65页 |
| 第三章 嗜热子囊菌光孢变种几丁质酶基因在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达 | 第65-98页 |
| 1 材料和方法 | 第65-80页 |
| ·实验材料 | 第65-70页 |
| ·菌株和质粒 | 第65-66页 |
| ·酶和生化试剂 | 第66页 |
| ·培养基及有关溶液的配制 | 第66-69页 |
| ·主要仪器设备 | 第69-70页 |
| ·实验方法 | 第70-80页 |
| ·几丁质酶基因片段的分离 | 第70-71页 |
| ·几丁质酶基因序列的限制性酶切位点分析 | 第70页 |
| ·引物设计 | 第70-71页 |
| ·几丁质酶基因在大肠杆菌中的表达 | 第71-73页 |
| ·几丁质酶基因原核表达载体的构建 | 第71-72页 |
| ·几丁质酶基因的原核诱导表达 | 第72页 |
| ·表达蛋白的可溶性分析 | 第72页 |
| ·表达蛋白的几丁质酶活性测定 | 第72-73页 |
| ·几丁质基因在毕赤酵母中的表达 | 第73-80页 |
| ·酵母表达载体的构建 | 第73-74页 |
| ·酵母转化 | 第74-76页 |
| ·线性化质粒 DNA 的制备 | 第74页 |
| ·Pichia pastoris GS115 感受态细胞的制备（电击法） | 第74-75页 |
| ·电击转化酵母感受态细胞 | 第75-76页 |
| ·酵母转化子的筛选与鉴定 | 第76-78页 |
| ·酵母转化子甲醇利用表型的平板筛选 | 第76页 |
| ·酵母基因组 DNA 的分离 | 第76-78页 |
| ·酵母转化子的 PCR 鉴定 | 第78页 |
| ·外源基因多拷贝整合转化子筛选 | 第78-79页 |
| ·酵母工程菌的培养和几丁质酶的诱导表达 | 第79-80页 |
| ·重组酵母表达产物的生物学活性检测 | 第80页 |
| ·pPIC3.5K 胞内表达的酶活测定 | 第80页 |
| ·pPIC9K 分泌表达的酶活测定 | 第80页 |
| ·重组酵母表达产物的SDS-PAGE 分析 | 第80页 |
| 2. 结果与分析 | 第80-94页 |
| ·几丁质酶编码序列的分离 | 第80-82页 |
| ·几丁质酶基因在大肠杆菌中的表达 | 第82-85页 |
| ·几丁质酶基因重组表达载体的构建 | 第82-83页 |
| ·几丁质酶基因在大肠杆菌中的诱导表达 | 第83-84页 |
| ·表达蛋白的可溶性分析 | 第84-85页 |
| ·表达蛋白的几丁质酶活性测定 | 第85页 |
| ·几丁质酶基因在毕赤酵母中的表达 | 第85-94页 |
| ·酵母表达载体的构建和鉴定 | 第85-88页 |
| ·重组酵母转化子的筛选 | 第88-91页 |
| ·酵母转化子的甲醇利用表型的筛选 | 第88-89页 |
| ·酵母转化子的 PCR 鉴定 | 第89-90页 |
| ·几丁质酶基因多拷贝整合子的筛选 | 第90-91页 |
| ·几丁质酶基因在Pichia pastoris 中的表达 | 第91-94页 |
| ·几丁质酶基因在 Pichia pastoris 中的胞内表达 | 第91页 |
| ·几丁质酶基因在 Pichia pastoris 中的分泌表达 | 第91页 |
| ·重组酵母菌株产酶曲线测定 | 第91-92页 |
| ·几丁质酶基因表达产物的 SDS-PAGE 检测 | 第92-94页 |
| ·胞内表达重组酵母几丁质酶表达产物的SDS-PAGE 检测 | 第92页 |
| ·分泌表达重组酵母几丁质酶表达产物的SDS-PAGE 检测 | 第92-94页 |
| 3 讨论 | 第94-98页 |
| ·实验分析 | 第94页 |
| ·表达系统的选择 | 第94-96页 |
| ·酵母细胞的破壁方法 | 第96页 |
| ·真核表达载体的线性化 | 第96-98页 |
| 第四章 嗜热子囊菌光孢变种几丁质酶基因分泌表达产物的纯化及其性质研究 | 第98-107页 |
| 1 材料和方法 | 第98-101页 |
| ·实验材料 | 第98-99页 |
| ·几丁质酶工程菌株 | 第98页 |
| ·主要试剂 | 第98-99页 |
| ·培养基 | 第99页 |
| ·主要仪器设备 | 第99页 |
| ·实验方法 | 第99-101页 |
| ·巴斯德毕赤酵母分泌表达产物的纯化 | 第99页 |
| ·表达产物的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 | 第99-100页 |
| ·几丁质酶酶学特性的研究 | 第100-101页 |
| ·反应最适温度 | 第100页 |
| ·热稳定性 | 第100页 |
| ·反应最适pH 值 | 第100-101页 |
| ·pH 值稳定性 | 第101页 |
| ·各种金属离子对几丁质酶活性的影响 | 第101页 |
| 2 结果与分析 | 第101-104页 |
| ·重组几丁质酶的纯化 | 第101-102页 |
| ·重组几丁质酶的最适反应温度 | 第102页 |
| ·重组几丁质酶的热稳定性 | 第102-103页 |
| ·重组几丁质酶的最适反应pH 值 | 第103-104页 |
| ·金属离子对重组几丁质酶活性的影响 | 第104页 |
| 3 讨论 | 第104-107页 |
| ·几丁质酶的热稳定性 | 第104-105页 |
| ·几丁质酶酶活的大小 | 第105页 |
| ·几丁质酶的pH 稳定性 | 第105-107页 |
| 第五章 结果和展望 | 第107-109页 |
| 1 结果 | 第107-108页 |
| 2 展望 | 第108-109页 |
| 参考文献 | 第109-120页 |
| 致谢 | 第120页 |
