| 中文摘要 | 第1-12页 |
| Abstract | 第12-14页 |
| 第一章 文献综述 | 第14-28页 |
| 1 引言 | 第14页 |
| 2 玉米纹枯病研究进展 | 第14-20页 |
| ·症状 | 第15页 |
| ·病原菌 | 第15-18页 |
| ·病原菌的种类和融合群 | 第15-16页 |
| ·病原菌的生理生态和生物学特性 | 第16页 |
| ·病原菌的侵染循环 | 第16页 |
| ·致病机理 | 第16-18页 |
| ·玉米纹枯病的影响因素 | 第18页 |
| ·气候 | 第18页 |
| ·种植密度 | 第18页 |
| ·玉米纹枯病的防治 | 第18-19页 |
| ·农业防治 | 第18页 |
| ·化学防治 | 第18-19页 |
| ·生物防治 | 第19页 |
| ·玉米纹枯病抗病机制及抗病种质资源的筛选研究 | 第19-20页 |
| ·抗病机制 | 第19-20页 |
| ·抗病种质资源筛选 | 第20页 |
| 3 纤维素酶研究进展 | 第20-24页 |
| 4 酵母真核表达系统概述 | 第24-26页 |
| 5 本研究的立题依据、研究内容和技术路线 | 第26-28页 |
| ·立题依据 | 第26页 |
| ·研究内容 | 第26-27页 |
| ·技术路线 | 第27-28页 |
| 第二章 玉米纹枯病菌（R. SOLANI AG-1-IA）Β-1,4-内切纤维素酶的分离纯化、性质测定及功能研究 | 第28-40页 |
| 1 材料和方法 | 第28-34页 |
| ·实验材料 | 第28-29页 |
| ·供试菌株 | 第28页 |
| ·培养基 | 第28页 |
| ·固体PDA 培养基 | 第28页 |
| ·改良的Marcus 培养基 | 第28页 |
| ·主要仪器和试剂 | 第28-29页 |
| ·仪器设备 | 第28-29页 |
| ·试剂 | 第29页 |
| ·实验方法 | 第29-34页 |
| ·液体培养R. solani | 第29页 |
| ·不同培养时间对R. solani β-1,4-内切纤维素酶产生的影响 | 第29页 |
| ·酶活性测定 | 第29-30页 |
| ·测定方法 | 第29-30页 |
| ·酶的活力单位(U) | 第30页 |
| ·蛋白质含量测定 | 第30页 |
| ·R. solani 产β-1,4-内切纤维素酶的分离纯化 | 第30-31页 |
| ·粗酶液的制备 | 第30页 |
| ·硫酸铵沉淀 | 第30页 |
| ·Phenyl-Sepharose 疏水柱层析 | 第30页 |
| ·DEAE-Sepharose 弱阴离子交换柱层析 | 第30-31页 |
| ·纯度鉴定 | 第31-33页 |
| ·电泳操作步骤 | 第31-32页 |
| ·溶液的配制 | 第32-33页 |
| ·SDS-PAGE 蛋白质分子量的测定 | 第33页 |
| ·R. solani β-1,4-内切纤维素酶性质的研究 | 第33-34页 |
| ·R. solani β-1,4-内切纤维素酶的反应最适温度 | 第33页 |
| ·R. solani β-1,4-内切纤维素酶的反应最适pH 值 | 第33-34页 |
| ·R. solani β-1,4-内切纤维素酶的功能研究 | 第34页 |
| 2. 结果与分析 | 第34-39页 |
| ·不同培养时间对R. solani 产生的β-1,4-内切纤维素酶的影响 | 第34-35页 |
| ·R. solani 产β-1,4-内切纤维素酶的分离纯化及鉴定 | 第35-36页 |
| ·Phenyl-Sepharose 疏水柱层析 | 第35页 |
| ·DEAE-Sepharose 阴离子交换柱层析 | 第35-36页 |
| ·R. solani 产β-1,4-内切纤维素酶的纯化过程总表 | 第36页 |
| ·R. solani 产β-1,4-内切纤维素酶的一般性质 | 第36-38页 |
| ·R. solani 产β-1,4-内切纤维素酶的分子量 | 第36-37页 |
| ·R. solani 产β-1,4-内切纤维素酶的反应最适温度 | 第37页 |
| ·R. solani 产β-1,4-内切纤维素酶的反应最适pH 值 | 第37-38页 |
| ·R. solani 产β-1,4-内切纤维素酶对玉米叶片的影响 | 第38-39页 |
| 3 讨论 | 第39-40页 |
| 第三章 玉米纹枯病菌（R. SOLANI AG-1-IA）Β-1,4-内切纤维素酶的基因克隆及其序列分析 | 第40-64页 |
| 1 材料和方法 | 第40-41页 |
| ·材料 | 第40-41页 |
| ·供试菌株 | 第40页 |
| ·菌株与质粒 | 第40页 |
| ·酶和生化试剂 | 第40页 |
| ·仪器 | 第40页 |
| ·培养基 | 第40-41页 |
| ·溶液配制 | 第41页 |
| ·方法 | 第41-50页 |
| ·引物设计 | 第41-42页 |
| ·总RNA 的提取（Trizol 法） | 第42-44页 |
| ·反转录cDNA 第一链的合成 | 第44页 |
| ·β-1,4-内切纤维素酶基因cDNA 中间片段的分离 | 第44-47页 |
| ·β-1,4-内切纤维素酶基因cDNA 中间片段的扩增 | 第44-45页 |
| ·PCR 产物回收 | 第45-46页 |
| ·与载体连接 | 第46页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 | 第46-47页 |
| ·重组质粒的筛选与鉴定 | 第47页 |
| ·R. solani β-1,4-内切纤维素酶基因3’末端的分离（3’-RACE） | 第47-48页 |
| ·R. solani β-1,4-内切纤维素酶基因5’末端的分离（TAIL- PCR） | 第48-49页 |
| ·菌丝体DNA 的抽提 | 第48-49页 |
| ·R. solani β-1,4-内切纤维素酶基因5’末端的分离 | 第49页 |
| ·R. solani β-1,4-内切纤维素酶基因全长cDNA 的克隆 | 第49页 |
| ·R. solani β-1,4-内切纤维素酶基因全长序列的生物信息学分析 | 第49-50页 |
| ·R. solani β-1,4-内切纤维素酶 Genomic DNA 的克隆及序列分析 | 第50页 |
| ·R. solani Genomic DNA PCR 扩增 | 第50页 |
| ·β-1,4-内切纤维素酶基因的核苷酸序列分析 | 第50页 |
| ·β-1,4-内切纤维素酶基因的氨基酸序列分析 | 第50页 |
| 2. 结果与分析 | 第50-62页 |
| ·R. solani 总RNA 的提取 | 第50-51页 |
| ·R. solani β-1,4-内切纤维素酶基因的分离 | 第51-62页 |
| ·R. solani β-1,4-内切纤维素酶基因中间片段的分离 | 第51-52页 |
| ·R. solani β-1,4-内切纤维素酶基因3’末端cDNA 的分离 | 第52-53页 |
| ·R. solani β-1,4-内切纤维素酶基因cDNA 5’末端的分离 | 第53页 |
| ·R. solani β-1,4-内切纤维素酶基因ORF cDNA 的分离及扩增片断的序列拼接 | 第53-55页 |
| ·R. solani β-1,4-内切纤维素酶基因Genomic DNA 的扩增 | 第55-56页 |
| ·R. solani β-1,4-内切纤维素酶基因的核苷酸序列和推测的氨基酸序列分析 | 第56-58页 |
| ·R. solani β-1,4-内切纤维素酶基因的氨基酸序列分析 | 第58-62页 |
| ·EGIII 信号肽序列分析 | 第58-59页 |
| ·糖基化位点、分子量和等点预测 | 第59页 |
| ·氨基酸序列同源性分析 | 第59-62页 |
| 3. 讨论 | 第62-64页 |
| ·RNA 提取 | 第62页 |
| ·TAIL-PCR 扩增基因 | 第62-63页 |
| ·扩增基因全长的起始密码子端的上游引物的设计 | 第63-64页 |
| 第四章 玉米纹枯病菌（R. SOLANI AG-1-IA）Β-1,4-内切纤维素酶基因在毕赤酵母中的表达 | 第64-84页 |
| 1 材料和方法 | 第64-73页 |
| ·材料 | 第64-66页 |
| ·菌株和质粒 | 第64页 |
| ·酶和生化试剂 | 第64页 |
| ·培养基及有关溶液的配制 | 第64-65页 |
| ·主要仪器设备 | 第65-66页 |
| ·试验方法 | 第66-73页 |
| ·R. solani EGIII 成熟肽基因序列的分离 | 第66-67页 |
| ·R. solani EGIII 成熟肽基因序列的限制性酶切位点分析 | 第66页 |
| ·引物设计和R. solani EGIII 成熟肽基因序列的分离 | 第66-67页 |
| ·R. solani EGIII 在毕赤酵母中的表达 | 第67-73页 |
| ·酵母表达载体的构建 | 第67页 |
| ·线性化质粒DNA 制备 | 第67-68页 |
| ·酵母转化 | 第68-69页 |
| ·酵母转化子的筛选与鉴定 | 第69-70页 |
| ·酵母转化子的PCR 鉴定 | 第70-71页 |
| ·外源基因多拷贝整合转化子筛选 | 第71-72页 |
| ·酵母工程菌的培养和R. solani EGIII 的诱导分泌表达 | 第72页 |
| ·表达产物β-1,4-内切纤维素酶的生物学活性检测 | 第72页 |
| ·表达产物β-1,4-内切纤维素酶的SDS-PAGE 分析 | 第72-73页 |
| ·β-1,4-内切纤维素酶工程菌产酶曲线的测定 | 第73页 |
| ·β-1,4-内切纤维素酶工程菌表达产物的酶学性质 | 第73页 |
| ·β-1,4-内切纤维素酶基因表达产物的功能研究 | 第73页 |
| 2. 结果与分析 | 第73-83页 |
| ·R. solani EGIII 成熟肽基因序列的分离 | 第73-74页 |
| ·R. solani EGIII 成熟肽基因序列的限制性酶切位点分析结果 | 第73-74页 |
| ·R. solani EGIII 成熟肽基因序列的分离 | 第74页 |
| ·R. solani EGIII 基因在毕赤酵母中的表达 | 第74-83页 |
| ·酵母表达载体的构建和鉴定 | 第74-76页 |
| ·重组酵母表达质粒pPIC9K/eg 转化 P. pastoris GS115 及酵母转化子的验证 | 第76-79页 |
| ·酵母转化子的甲醇利用表型的筛选 | 第76-77页 |
| ·毕赤酵母转化子的PCR 鉴定 | 第77-78页 |
| ·R. solani EGIII 基因多拷贝整合子的筛选 | 第78-79页 |
| ·R.solani EGIII 基因在P. pastoris 中的高效表达及表达产物的检测 | 第79-81页 |
| ·R. solani EGIII 基因在P. pastoris 中的诱导表达和高效表达酵母菌株的筛选 | 第79页 |
| ·R. solani EGIII 酵母工程菌产酶曲线的测定 | 第79页 |
| ·R. solani EGIII 表达产物的SDS-PAGE 检测 | 第79-81页 |
| ·表达R. solani EGIII 的酶学性质研究 | 第81-82页 |
| ·表达R. solani EGIII 的最适反应温度 | 第81-82页 |
| ·表达R. solani EGIII 的最适反应pH 值 | 第82页 |
| ·表达R. solani EGIII 的酶功能研究 | 第82-83页 |
| 3 讨论 | 第83-84页 |
| 第五章 结论和建议 | 第84-85页 |
| 1 结论 | 第84页 |
| 2 建议 | 第84-85页 |
| 参考文献 | 第85-95页 |
| 致谢 | 第95页 |
