| 摘要 | 第12-14页 |
| Abstract | 第14-15页 |
| 第一章 绪论 | 第16-35页 |
| 1.1 葡萄糖脱氢酶简介 | 第16-21页 |
| 1.2.1 葡萄糖脱氢酶的来源和分类 | 第16-17页 |
| 1.2.2 葡萄糖脱氢酶结构 | 第17-19页 |
| 1.2.3 葡萄糖脱氢酶催化反应类型 | 第19-21页 |
| 1.3 葡萄糖脱氢酶的应用 | 第21-25页 |
| 1.3.1 生物燃料电池 | 第21-22页 |
| 1.3.2 酶生物传感器 | 第22-23页 |
| 1.3.3 辅酶再生 | 第23-25页 |
| 1.4 辅酶NAD(P)及其类似物在氧化还原酶的研究现状 | 第25-28页 |
| 1.4.1 辅酶NAD(P)与氧化还原酶的研究现状 | 第26-27页 |
| 1.4.2 辅酶NAD(P)类似物的研究现状 | 第27-28页 |
| 1.5 蛋白质工程 | 第28-34页 |
| 1.5.1 定向进化 | 第29-32页 |
| 1.5.2 理性设计 | 第32-33页 |
| 1.5.3 半理性设计 | 第33-34页 |
| 1.6 选题背景和研究意义 | 第34-35页 |
| 第二章 材料与方法 | 第35-64页 |
| 2.1 实验材料和主要仪器 | 第35-37页 |
| 2.2 葡萄糖脱氢酶在大肠杆菌中的构建和重组表达 | 第37-45页 |
| 2.2.1 引物设计 | 第37-38页 |
| 2.2.2 重组质粒的构建与转化 | 第38-43页 |
| 2.2.3 重组菌的表达与优化 | 第43-45页 |
| 2.3 葡萄糖脱氢酶酶学性质分析实验 | 第45-46页 |
| 2.3.1 温度和pH对GDH酶活的影响 | 第45页 |
| 2.3.2 温度和pH对GDH酶稳定性的影响 | 第45页 |
| 2.3.3 GDH动力学参数测定 | 第45-46页 |
| 2.3.4 底物谱分析 | 第46页 |
| 2.4 双质粒表达系统构建 | 第46-53页 |
| 2.4.1 引物设计 | 第46-47页 |
| 2.4.2 双质粒的构建与转化 | 第47-52页 |
| 2.4.3 双质粒的表达 | 第52页 |
| 2.4.4 双质粒细胞制备和催化条件 | 第52-53页 |
| 2.5 葡萄糖脱氢酶定向进化方法设计 | 第53-58页 |
| 2.5.1 引物设计 | 第53页 |
| 2.5.2 高通量筛选平板的组成 | 第53-54页 |
| 2.5.3 与还原性辅酶发生特异性显色反应的染料筛选 | 第54-56页 |
| 2.5.4 易错PCR与突变文库构建 | 第56-57页 |
| 2.5.5 重组质粒的构建与转化 | 第57-58页 |
| 2.6 分析与测定方法 | 第58-64页 |
| 2.6.1 蛋白浓度测定 | 第58-59页 |
| 2.6.2 SDS-PAGE | 第59-60页 |
| 2.6.3 葡萄糖脱氢酶与亮氨酸脱氢酶酶活测定 | 第60-61页 |
| 2.6.4 L-叔亮氨酸检测方法 | 第61-64页 |
| 第三章 葡萄糖脱氢酶的表达优化和酶学性质研究 | 第64-79页 |
| 3.1 葡萄糖脱氢酶的重组表达和表达条件优化 | 第64-74页 |
| 3.1.1 重组菌BL21(pET28a-GDH)的构建 | 第64-66页 |
| 3.1.2 培养基对BL21(pET28a-GDH)表达酶活影响 | 第66-68页 |
| 3.1.3 IPTG添加时间对BL21(pET28a-GDH)表达酶活的影响 | 第68-69页 |
| 3.1.4 IPTG浓度对BL21(pET28a-GDH)表达酶活的影响 | 第69-70页 |
| 3.1.5 诱导时间对BL21(pET28a-GDH)表达酶活影响 | 第70-71页 |
| 3.1.6 培养温度对BL21(pET28a-GDH)表达酶活影响 | 第71-72页 |
| 3.1.7 摇瓶装液量对BL21(pET28a-GDH)表达酶活影响 | 第72-73页 |
| 3.1.8 初始pH对BL21(pET28a-GDH)表达酶活影响 | 第73-74页 |
| 3.2 葡萄糖脱氢酶的酶学性质研究 | 第74-78页 |
| 3.2.1 温度和pH对GDH酶活的影响 | 第74-75页 |
| 3.2.2 温度和pH对GDH酶稳定性的影响 | 第75-76页 |
| 3.2.3 GDH动力学参数测定 | 第76-77页 |
| 3.2.4 底物谱分析 | 第77-78页 |
| 3.3 本章小结 | 第78-79页 |
| 第四章 葡萄糖脱氢酶在合成L-叔亮氨酸中的应用 | 第79-87页 |
| 4.1 双质粒重组菌的构建 | 第79-82页 |
| 4.2 双质粒重组菌的转化和表达 | 第82-83页 |
| 4.3 重组菌株催化三甲基丙酮酸合成L-叔亮氨酸 | 第83-86页 |
| 4.4 本章小结 | 第86-87页 |
| 第五章 可利用仿生辅酶的GDH高效筛选方法建立 | 第87-101页 |
| 5.1 显色法高效筛选突变GDH的原理和方法设计 | 第87-89页 |
| 5.2 GDH突变文库的建立 | 第89页 |
| 5.3 亚甲基蓝显色法筛选突变GDH方法的验证 | 第89-91页 |
| 5.4 与还原性辅酶发生特异性显色反应的染料筛选 | 第91-99页 |
| 5.4.1 辅酶和染料的显色反应 | 第91-92页 |
| 5.4.2 PMS对辅酶和染料显色反应的影响 | 第92-93页 |
| 5.4.3 NADH和染料NBT反应的阈值 | 第93-94页 |
| 5.4.4 热处理对显色反应的影响 | 第94-95页 |
| 5.4.5 反应体系中背景干扰排除 | 第95-96页 |
| 5.4.6 细胞浓度及粗酶液浓度和NBT反应的研究 | 第96-97页 |
| 5.4.7 显色平板的筛选系统的验证 | 第97页 |
| 5.4.8 GDH定向进化和筛选结果 | 第97-99页 |
| 5.5 本章小结 | 第99-101页 |
| 第六章 结论与展望 | 第101-103页 |
| 6.1 结论 | 第101-102页 |
| 6.2 展望 | 第102-103页 |
| 参考文献 | 第103-115页 |
| 附录 | 第115-120页 |
| 附录一 主要试剂 | 第115-117页 |
| 附录二 主要仪器 | 第117-118页 |
| 附录三 本研究所使用到的部分基因序列 | 第118-120页 |
| 致谢 | 第120页 |
