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热稳定葡萄糖脱氢酶的表达及在合成L-叔亮氨酸中的应用

摘要第12-14页
Abstract第14-15页
第一章 绪论第16-35页
    1.1 葡萄糖脱氢酶简介第16-21页
        1.2.1 葡萄糖脱氢酶的来源和分类第16-17页
        1.2.2 葡萄糖脱氢酶结构第17-19页
        1.2.3 葡萄糖脱氢酶催化反应类型第19-21页
    1.3 葡萄糖脱氢酶的应用第21-25页
        1.3.1 生物燃料电池第21-22页
        1.3.2 酶生物传感器第22-23页
        1.3.3 辅酶再生第23-25页
    1.4 辅酶NAD(P)及其类似物在氧化还原酶的研究现状第25-28页
        1.4.1 辅酶NAD(P)与氧化还原酶的研究现状第26-27页
        1.4.2 辅酶NAD(P)类似物的研究现状第27-28页
    1.5 蛋白质工程第28-34页
        1.5.1 定向进化第29-32页
        1.5.2 理性设计第32-33页
        1.5.3 半理性设计第33-34页
    1.6 选题背景和研究意义第34-35页
第二章 材料与方法第35-64页
    2.1 实验材料和主要仪器第35-37页
    2.2 葡萄糖脱氢酶在大肠杆菌中的构建和重组表达第37-45页
        2.2.1 引物设计第37-38页
        2.2.2 重组质粒的构建与转化第38-43页
        2.2.3 重组菌的表达与优化第43-45页
    2.3 葡萄糖脱氢酶酶学性质分析实验第45-46页
        2.3.1 温度和pH对GDH酶活的影响第45页
        2.3.2 温度和pH对GDH酶稳定性的影响第45页
        2.3.3 GDH动力学参数测定第45-46页
        2.3.4 底物谱分析第46页
    2.4 双质粒表达系统构建第46-53页
        2.4.1 引物设计第46-47页
        2.4.2 双质粒的构建与转化第47-52页
        2.4.3 双质粒的表达第52页
        2.4.4 双质粒细胞制备和催化条件第52-53页
    2.5 葡萄糖脱氢酶定向进化方法设计第53-58页
        2.5.1 引物设计第53页
        2.5.2 高通量筛选平板的组成第53-54页
        2.5.3 与还原性辅酶发生特异性显色反应的染料筛选第54-56页
        2.5.4 易错PCR与突变文库构建第56-57页
        2.5.5 重组质粒的构建与转化第57-58页
    2.6 分析与测定方法第58-64页
        2.6.1 蛋白浓度测定第58-59页
        2.6.2 SDS-PAGE第59-60页
        2.6.3 葡萄糖脱氢酶与亮氨酸脱氢酶酶活测定第60-61页
        2.6.4 L-叔亮氨酸检测方法第61-64页
第三章 葡萄糖脱氢酶的表达优化和酶学性质研究第64-79页
    3.1 葡萄糖脱氢酶的重组表达和表达条件优化第64-74页
        3.1.1 重组菌BL21(pET28a-GDH)的构建第64-66页
        3.1.2 培养基对BL21(pET28a-GDH)表达酶活影响第66-68页
        3.1.3 IPTG添加时间对BL21(pET28a-GDH)表达酶活的影响第68-69页
        3.1.4 IPTG浓度对BL21(pET28a-GDH)表达酶活的影响第69-70页
        3.1.5 诱导时间对BL21(pET28a-GDH)表达酶活影响第70-71页
        3.1.6 培养温度对BL21(pET28a-GDH)表达酶活影响第71-72页
        3.1.7 摇瓶装液量对BL21(pET28a-GDH)表达酶活影响第72-73页
        3.1.8 初始pH对BL21(pET28a-GDH)表达酶活影响第73-74页
    3.2 葡萄糖脱氢酶的酶学性质研究第74-78页
        3.2.1 温度和pH对GDH酶活的影响第74-75页
        3.2.2 温度和pH对GDH酶稳定性的影响第75-76页
        3.2.3 GDH动力学参数测定第76-77页
        3.2.4 底物谱分析第77-78页
    3.3 本章小结第78-79页
第四章 葡萄糖脱氢酶在合成L-叔亮氨酸中的应用第79-87页
    4.1 双质粒重组菌的构建第79-82页
    4.2 双质粒重组菌的转化和表达第82-83页
    4.3 重组菌株催化三甲基丙酮酸合成L-叔亮氨酸第83-86页
    4.4 本章小结第86-87页
第五章 可利用仿生辅酶的GDH高效筛选方法建立第87-101页
    5.1 显色法高效筛选突变GDH的原理和方法设计第87-89页
    5.2 GDH突变文库的建立第89页
    5.3 亚甲基蓝显色法筛选突变GDH方法的验证第89-91页
    5.4 与还原性辅酶发生特异性显色反应的染料筛选第91-99页
        5.4.1 辅酶和染料的显色反应第91-92页
        5.4.2 PMS对辅酶和染料显色反应的影响第92-93页
        5.4.3 NADH和染料NBT反应的阈值第93-94页
        5.4.4 热处理对显色反应的影响第94-95页
        5.4.5 反应体系中背景干扰排除第95-96页
        5.4.6 细胞浓度及粗酶液浓度和NBT反应的研究第96-97页
        5.4.7 显色平板的筛选系统的验证第97页
        5.4.8 GDH定向进化和筛选结果第97-99页
    5.5 本章小结第99-101页
第六章 结论与展望第101-103页
    6.1 结论第101-102页
    6.2 展望第102-103页
参考文献第103-115页
附录第115-120页
    附录一 主要试剂第115-117页
    附录二 主要仪器第117-118页
    附录三 本研究所使用到的部分基因序列第118-120页
致谢第120页

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