| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5页 |
| 1. 前言 | 第8-16页 |
| 1.1 CRISPR技术的原理与应用 | 第8-9页 |
| 1.1.1 CRISPR研究历史 | 第8页 |
| 1.1.2 CRISPR的分类 | 第8-9页 |
| 1.1.3 CRISPR技术的原理与应用 | 第9页 |
| 1.2 Red重组系统 | 第9-11页 |
| 1.2.1 Red重组系统的组成 | 第9-10页 |
| 1.2.2 Red重组系统的原理 | 第10页 |
| 1.2.3 Red重组技术的应用 | 第10-11页 |
| 1.3 大肠杆菌在生物研究中的应用 | 第11页 |
| 1.3.1 大肠杆菌 | 第11页 |
| 1.3.2 大肠杆菌的应用 | 第11页 |
| 1.4 细菌膜泡 | 第11-12页 |
| 1.5 无乳链球菌 | 第12页 |
| 1.6 目的与意义 | 第12-14页 |
| 1.7 技术路线 | 第14-16页 |
| 1.7.1 双质粒构建技术路线 | 第14-15页 |
| 1.7.2 利用CRISPR与膜泡对无乳链球菌防治的技术路线 | 第15-16页 |
| 2 材料与方法 | 第16-29页 |
| 2.1 实验材料与试剂 | 第16-23页 |
| 2.1.1 实验中用到的菌株与引物 | 第16-21页 |
| 2.1.2 试剂及仪器 | 第21-23页 |
| 2.2 实验方法 | 第23-29页 |
| 2.2.1 pCSK与pKS9质粒构建 | 第23-24页 |
| 2.2.2 更换靶点 | 第24页 |
| 2.2.3 用于重组的大肠杆菌电击感受态细胞的制备 | 第24-25页 |
| 2.2.4 大肠杆菌的电击转化 | 第25页 |
| 2.2.5 制备麦康凯培养基 | 第25页 |
| 2.2.6 质粒消除 | 第25-26页 |
| 2.2.7 pCas9-2.0与pCas9-cfb质粒的构建 | 第26-27页 |
| 2.2.8 大肠杆菌膜泡的收集与电镜观察 | 第27页 |
| 2.2.9 探究影响膜泡分泌量条件 | 第27页 |
| 2.2.10 质粒的膜泡转运与菌株消除 | 第27-28页 |
| 2.2.11 无乳链球菌电转感受态的制备与电击操作 | 第28页 |
| 2.2.12 统计分析 | 第28-29页 |
| 3 实验结果 | 第29-48页 |
| 3.1 三质粒系统在大肠杆菌基因编辑中的应用 | 第29-33页 |
| 3.1.1 三质粒系统的结构及原理 | 第29-30页 |
| 3.1.2 galK基因的点突变 | 第30-31页 |
| 3.1.3 galK基因的敲除 | 第31-33页 |
| 3.2 新双质粒系统的应用 | 第33-43页 |
| 3.2.1 新双质粒系统原理 | 第33-34页 |
| 3.2.2 PAM依赖型与PAM非依赖型的点突变 | 第34-38页 |
| 3.2.3 基因的敲除与插入(galk基因的敲除与lacZ'片段的插入) | 第38-41页 |
| 3.2.4 双靶点的基因编辑 | 第41-42页 |
| 3.2.5 双质粒消除 | 第42-43页 |
| 3.3 利用膜泡传递与CRISPR技术结合对无乳链球菌进行防治 | 第43-48页 |
| 3.3.1 膜泡传递与CRISPR技术结合原理 | 第43-44页 |
| 3.3.2 膜泡收集与PCR验证图 | 第44-45页 |
| 3.3.3 质粒穿梭验证以及穿梭效率条件探索 | 第45-47页 |
| 3.3.4 CRISPR与膜泡传递的结合对无乳链球菌的致死作用 | 第47-48页 |
| 4 分析与讨论 | 第48-51页 |
| 4.1 三质粒系统可行性 | 第48页 |
| 4.2 新双质粒系统 | 第48-49页 |
| 4.3 利用膜泡传递与CRISPR技术结合对病原菌防治 | 第49-51页 |
| 5 结论 | 第51-52页 |
| 参考文献 | 第52-59页 |
| 在读期间发表论文 | 第59-60页 |
| 致谢 | 第60-61页 |
