| 摘要 | 第3-6页 |
| Abstract | 第6-9页 |
| 缩略词汇总表 | 第10-15页 |
| 第1章 引言 | 第15-25页 |
| 1.1 文献综述 | 第15-23页 |
| 1.1.1 分子伴侣的概念 | 第15页 |
| 1.1.2 分子伴侣DnaJ的研究进展 | 第15-19页 |
| 1.1.3 分子伴侣的主要生物学功能 | 第19页 |
| 1.1.4 分子伴侣在基因工程上的应用 | 第19-23页 |
| 1.2 本论文的研究目的及意义 | 第23-25页 |
| 第2章 材料与方法 | 第25-47页 |
| 2.1 材料 | 第25-31页 |
| 2.1.1 宿主菌及载体 | 第25页 |
| 2.1.2 主要试剂 | 第25-26页 |
| 2.1.3 常用试剂配制 | 第26-29页 |
| 2.1.4 主要仪器设备 | 第29-30页 |
| 2.1.5 本工作所用引物 | 第30-31页 |
| 2.2 实验方法 | 第31-47页 |
| 2.2.1 含分子伴侣基因的原核表达载体构建 | 第31-38页 |
| 2.2.1.1 大肠杆菌基因组DNA的提取 | 第31-32页 |
| 2.2.1.2 核酸琼脂糖凝胶电泳 | 第32页 |
| 2.2.1.3 DnaJ基因的扩增 | 第32-34页 |
| 2.2.1.4 DNA琼脂糖凝胶电泳纯化回收DNA片段 | 第34页 |
| 2.2.1.5 PCR产物的酶切 | 第34-35页 |
| 2.2.1.6 DNA片段的纯化回收 | 第35页 |
| 2.2.1.7 载体pET32a(+)的酶切 | 第35-36页 |
| 2.2.1.8 基因片段和载体片段连接及转化 | 第36-37页 |
| 2.2.1.9 菌落PCR鉴定阳性重组子 | 第37页 |
| 2.2.1.10 重组质粒的提取 | 第37-38页 |
| 2.2.2 DnaJ的融合表达载体构建 | 第38-39页 |
| 2.2.2.1 超酸性接头酶切片段的制备 | 第38页 |
| 2.2.2.2 重组载体酶切片段的制备 | 第38-39页 |
| 2.2.2.3 连接及转化 | 第39页 |
| 2.2.2.4 阳性重组克隆的筛选及质粒DNA的提取 | 第39页 |
| 2.2.2.5 阳性重组质粒转化BL21(DE3) | 第39页 |
| 2.2.2.6 载体pET(X-DnaJ-ra3t)及pET(X-J-tua2)的制备 | 第39页 |
| 2.2.3 含靶蛋白基因的原核表达载体构建 | 第39-45页 |
| 2.2.3.1 载体pAY(JcAPX1)的构建 | 第39-41页 |
| 2.2.3.2 载体pAY(EGFP)的构建 | 第41-42页 |
| 2.2.3.3 载体pAY(EcMetA)、pAY(JcTBP1)、pAY(NtRCA)、pAY(DnaJ)的构建 | 第42页 |
| 2.2.3.4 载体pAY(NtrbcL)的制备 | 第42-43页 |
| 2.2.3.5 载体pAY(BoWCP)的构建 | 第43-45页 |
| 2.2.3.6 DnaJ及其融合蛋白的酵母表达载体构建 | 第45页 |
| 2.2.4 DnaJ及其融合蛋白的诱导表达 | 第45-46页 |
| 2.2.5 胶活性染色 | 第46页 |
| 2.2.6 分光光度法测定JcAPX1酶活 | 第46页 |
| 2.2.7 酵母菌稀释点板 | 第46-47页 |
| 第3章 结果与分析 | 第47-71页 |
| 3.1 载体构建 | 第47-55页 |
| 3.1.1 含分子伴侣基因的原核表达载体构建 | 第47-50页 |
| 3.1.1.1 DnaJ原核表达载体的构建 | 第47-48页 |
| 3.1.1.2 DnaK、GrpE的原核表达载体构建 | 第48页 |
| 3.1.1.3 DnaJ的融合表达载体构建 | 第48-50页 |
| 3.1.2 含靶蛋白基因的原核表达载体构建 | 第50-55页 |
| 3.1.2.1 靶蛋白的选择 | 第50-52页 |
| 3.1.2.2 含靶蛋白基因的原核表达载体构建 | 第52-55页 |
| 3.2 大肠杆菌DnaK、DnaJ、GrpE分子伴侣系统蛋白表达分析 | 第55-56页 |
| 3.3 超酸性融合DnaJ蛋白的可溶性分析 | 第56-57页 |
| 3.4 共表达分析 | 第57-68页 |
| 3.4.1 与DnaJ系列载体共表达的APX1可溶性和酶活性分析 | 第58-62页 |
| 3.4.1.1 与DnaJ系列载体共表达的APX1可溶性分析 | 第58-59页 |
| 3.4.1.2 与DnaJ系列载体共表达的APX1酶活性分析 | 第59-61页 |
| 3.4.1.3 与加双接头DnaJ融合表达载体共表达的APX1可溶性分析 | 第61-62页 |
| 3.4.2 与DnaJ系列载体共表达的GFP可溶性和荧光活性分析 | 第62-63页 |
| 3.4.2.1 与DnaJ系列载体共表达的GFP可溶性分析 | 第62页 |
| 3.4.2.2 与DnaJ系列载体共表达的GFP荧光活性分析 | 第62-63页 |
| 3.4.3 与DnaJ系列载体共表达的MetA可溶性及其共表达重组大肠杆菌的耐热性分析 | 第63-65页 |
| 3.4.3.1 与DnaJ系列载体共表达的MetA可溶性分析 | 第63-64页 |
| 3.4.3.2 DnaJ系列载体与MetA共表达的重组大肠杆菌菌株的耐热性分析 | 第64-65页 |
| 3.4.4 与DnaJ系列载体共表达的其他靶蛋白的可溶性分析 | 第65-68页 |
| 3.4.4.1 与DnaJ系列载体共表达的rbcL可溶性分析 | 第65页 |
| 3.4.4.2 与DnaJ系列载体共表达的RCA可溶性分析 | 第65-66页 |
| 3.4.4.3 与DnaJ系列载体共表达的WCP可溶性分析 | 第66-67页 |
| 3.4.4.4 与DnaJ系列载体共表达的TBP1可溶性分析 | 第67-68页 |
| 3.5 DnaJ系列重组大肠杆菌及酵母菌菌株的耐热性分析 | 第68-70页 |
| 3.5.1 DnaJ系列重组大肠杆菌菌株的耐热性分析 | 第68-69页 |
| 3.5.2 DnaJ系列重组酵母菌菌株的耐热性分析 | 第69-70页 |
| 3.6 与DnaJ系列载体共表达的DnaJ可溶性分析 | 第70-71页 |
| 第4章 总结与讨论 | 第71-75页 |
| 参考文献 | 第75-81页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文和研究成果 | 第81-82页 |
| 致谢 | 第82页 |
