| 摘要 | 第4-8页 |
| ABSTRACT | 第8-11页 |
| 第一章 文献综述 | 第16-34页 |
| 1.1 胚胎干细胞概况 | 第16-20页 |
| 1.1.1 Naive状态的胚胎干细胞 | 第16-17页 |
| 1.1.2 Prime状态的胚胎干细胞 | 第17-19页 |
| 1.1.3 Naive状态的胚胎干细胞与Prime状态的胚胎干细胞之间的状态转换 | 第19-20页 |
| 1.2 体细胞重编程的研究概况 | 第20-21页 |
| 1.3 牛胚胎干细胞和iPSC技术的研究情况 | 第21-22页 |
| 1.4 基因OCT4和NANOG在细胞重编程和胚胎发育方面的研究进展 | 第22-28页 |
| 1.4.1 基因OCT4在细胞重编程及胚胎发育中的研究概况 | 第22-26页 |
| 1.4.2 基因NANOG在细胞重编程及胚胎发育中的研究概况 | 第26-28页 |
| 1.5 运用绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)构建多能性基因的报告基因体系在干细胞和细胞重编程中的应用 | 第28-29页 |
| 1.6 病毒转染体系 | 第29-31页 |
| 1.6.1 逆转录病毒载体 | 第29-31页 |
| 1.6.2 慢病毒载体 | 第31页 |
| 1.7 本课题的目的、研究意义和技术路线 | 第31-34页 |
| 第二章 牛源OCT4和NANOG荧光报告系统的构建及验证 | 第34-68页 |
| 2.1 材料和方法 | 第34-58页 |
| 2.1.1 实验材料 | 第34-35页 |
| 2.1.2 试剂来源 | 第35页 |
| 2.1.3 主要溶液的配置 | 第35-37页 |
| 2.1.4 实验仪器 | 第37页 |
| 2.1.5 生物信息学分析工具 | 第37-38页 |
| 2.1.6 引物合成 | 第38页 |
| 2.1.7 牛OCT4和NANOG报告基因的构建 | 第38-46页 |
| 2.1.8 牛OCT4和NANOG报告基因慢病毒制备 | 第46-56页 |
| 2.1.9 EB标志基因的检测 | 第56-58页 |
| 2.1.10 软件分析 | 第58页 |
| 2.2 结果 | 第58-65页 |
| 2.2.1 牛OCT4和NANOG基因增强子片段的扩增 | 第58-59页 |
| 2.2.2 牛OCT4和NANOG报告基因载体的检测 | 第59页 |
| 2.2.3 牛OCT4增强子在Naive状态的干细胞中的活性检测 | 第59-60页 |
| 2.2.4 牛OCT4增强子在Prime时期的干细胞中的活性检测 | 第60-61页 |
| 2.2.5 牛NANOG增强子在Naive状态的小鼠胚胎干细胞中的活性检测 | 第61-62页 |
| 2.2.6 牛NANOG增强子在Prime时期的人胚胎干细胞中的活性检测 | 第62-63页 |
| 2.2.7 牛OCT4报告基因在干细胞分化时的表达情况 | 第63-65页 |
| 2.3 讨论 | 第65-67页 |
| 2.4 小结 | 第67-68页 |
| 第三章 牛源OCT4远端和近端增强子荧光报告质粒的构建以及其在Naive和Prime状态干细胞中激活状态分析 | 第68-100页 |
| 3.1 材料和方法 | 第68-87页 |
| 3.1.1 实验材料 | 第68-69页 |
| 3.1.2 试剂来源 | 第69页 |
| 3.1.3 主要溶液的配制 | 第69-71页 |
| 3.1.4 实验仪器 | 第71-72页 |
| 3.1.5 生物信息学分析工具 | 第72页 |
| 3.1.6 引物合成 | 第72页 |
| 3.1.7 牛OCT4和NANOG报告基因的构建 | 第72-76页 |
| 3.1.7.1 牛远端和近端增强子片段扩增 | 第72-73页 |
| 3.1.7.2 胶回收目的条带 | 第73-74页 |
| 3.1.7.3 将目的条带连接pGreenFire载体中 | 第74页 |
| 3.1.7.4 连接产物的转化及质粒扩增 | 第74-76页 |
| 3.1.8 牛OCT4近端增强子和远端增强子报告基因慢病毒制备 | 第76-78页 |
| 3.1.9 病毒感染目的细胞检测质粒构建的情况 | 第78-79页 |
| 3.1.10 感染小鼠胚胎千细胞并检测荧光 | 第79-82页 |
| 3.1.11 将小鼠胚胎干细胞从Native状态向Prime状态分化及检测 | 第82-85页 |
| 3.1.11.1 将小鼠胚胎千细胞向Prime状态分化 | 第82页 |
| 3.1.11.2 小鼠Naive和Prime状态干细胞的标志基因检测 | 第82-84页 |
| 3.1.11.3 免疫荧光检测Naive和Prime状态的小鼠干细胞的多能性基因的表达情况 | 第84-85页 |
| 3.1.12 EB body诱导 | 第85页 |
| 3.1.13 流式细胞仪检测荧光 | 第85-87页 |
| 3.1.14 将Prime状态的小鼠干细胞向Nave状态诱导 | 第87页 |
| 3.1.15 软件分析 | 第87页 |
| 3.2 结果 | 第87-97页 |
| 3.2.1 牛OCT4基因近端增强子、远端增强子和近端启动子片段的扩增结果 | 第87-88页 |
| 3.2.2 牛OCT4基因近端增强子和远端增强子在Naive状态干细胞中活性检测 | 第88-90页 |
| 3.2.3 牛OCT4远端增强子报告基因在干细胞分化后的表达情况 | 第90-94页 |
| 3.2.4 牛OCT4远端增强子报告基因在Prime状态的干细胞中的活性检测 | 第94-97页 |
| 3.3 讨论 | 第97-99页 |
| 3.4 小结 | 第99-100页 |
| 第四章 牛源OCT4报告基因质粒在小鼠重编程过程中的应用 | 第100-112页 |
| 4.1 材料和方法 | 第100-108页 |
| 4.1.1 实验材料 | 第100页 |
| 4.1.2 试剂来源 | 第100-101页 |
| 4.1.3 主要溶液的配置 | 第101-102页 |
| 4.1.4 实验仪器 | 第102-103页 |
| 4.1.5 引物合成 | 第103页 |
| 4.1.6 包装体细胞重编程慢病毒 | 第103-105页 |
| 4.1.7 小鼠体细胞重编程 | 第105-106页 |
| 4.1.8 iPS细胞多能性基因的鉴定 | 第106-108页 |
| 4.2 结果 | 第108-110页 |
| 4.2.1 将牛OCT4报告基因同重编程因子一同感染b6/129胎鼠成纤维细胞 | 第108-109页 |
| 4.2.2 iPS克隆进行鉴定 | 第109-110页 |
| 4.3 讨论 | 第110-111页 |
| 4.4 小结 | 第111-112页 |
| 全文总结和研究展望 | 第112-114页 |
| 主要缩略词对照 | 第114-115页 |
| 参考文献 | 第115-122页 |
| 致谢 | 第122-124页 |
| 攻读学位期间发表论文情况 | 第124-125页 |
