| 摘要 | 第8-9页 |
| Abstract | 第9页 |
| 缩略词 | 第10-11页 |
| 第一章 绪论 | 第11-20页 |
| 1.1 芜菁花叶病毒基因组结构和功能 | 第11-14页 |
| 1.2 芜菁花叶病毒分类研究 | 第14-15页 |
| 1.3 植物宿主对TUMV的内源抗性 | 第15-17页 |
| 1.3.1 普遍性抗性 | 第15-16页 |
| 1.3.2 R基因抗性 | 第16页 |
| 1.3.3 广谱性抗性 | 第16-17页 |
| 1.4 RNAi机制 | 第17-18页 |
| 1.4.1 siRNA作用机制 | 第17页 |
| 1.4.2 miRNA作用机制 | 第17页 |
| 1.4.3 转基因研究 | 第17-18页 |
| 1.5 展望 | 第18-19页 |
| 1.6 研究目的及意义 | 第19-20页 |
| 第二章 CI基因的RNAi载体构建及抗病分析 | 第20-38页 |
| 2.1 试验材料 | 第20页 |
| 2.1.1 植物材料 | 第20页 |
| 2.1.2 载体和菌株 | 第20页 |
| 2.1.3 主要试剂和培养基 | 第20页 |
| 2.2 试验方法 | 第20-31页 |
| 2.2.1 CI目的基因克隆 | 第20-21页 |
| 2.2.1.1 琼脂糖凝胶回收 | 第20-21页 |
| 2.2.2 pHannibal-CI RNAi载体的构建 | 第21-24页 |
| 2.2.2.1 PCR产物纯化回收 | 第21页 |
| 2.2.2.2 感受态细胞的制备 | 第21页 |
| 2.2.2.3 大肠杆菌热击转化 | 第21-22页 |
| 2.2.2.4 重组质粒DNA的小量提取 | 第22页 |
| 2.2.2.5 反向片段的连接 | 第22-23页 |
| 2.2.2.6 正向片段的连接 | 第23-24页 |
| 2.2.2.7 pHannibal-CI RNAi载体的酶切验证 | 第24页 |
| 2.2.3 植物表达载体pBBBast-CI的构建 | 第24-26页 |
| 2.2.3.1 目的NotⅠ片段的酶切 | 第24页 |
| 2.2.3.2 载体片段酶切 | 第24页 |
| 2.2.3.3 目的片段与载体连接 | 第24-26页 |
| 2.2.3.4 农杆菌GV3101:pMP90感受态细胞的制备 | 第26页 |
| 2.2.3.5 农杆菌GV3101:pMP90感受态细胞电击转化 | 第26页 |
| 2.2.4 拟南芥的遗传转化及转基因阳性苗的筛选和鉴定 | 第26-27页 |
| 2.2.4.1 农杆菌的准备 | 第26-27页 |
| 2.2.4.2 拟南芥材料的准备 | 第27页 |
| 2.2.4.3 花序浸渍法侵染拟南芥 | 第27页 |
| 2.2.4.4 小量快速提取拟南芥DNA | 第27页 |
| 2.2.5 转基因拟南芥单拷贝基因的初步鉴定 | 第27-28页 |
| 2.2.6 转基因植株病情指数统计 | 第28-29页 |
| 2.2.6.1 机械传染病毒的接种(汁液摩擦传染) | 第28-29页 |
| 2.2.7 转基因植株抗病的半定量分析 | 第29-30页 |
| 2.2.7.1 植物总RNA的提取 | 第29页 |
| 2.2.7.2 去除RNA中的基因组DNA的污染 | 第29-30页 |
| 2.2.7.3 cDNA第一链的合成 | 第30页 |
| 2.2.8 转基因植株抗病的相对定量分析 | 第30-31页 |
| 2.3 结果与分析 | 第31-38页 |
| 2.3.1 CI目的基因的获得 | 第31页 |
| 2.3.2 pHannibal-CI RNAi载体的构建 | 第31-33页 |
| 3.3.2.1 反向片段连接入RNAi载体 | 第31-32页 |
| 2.3.2.2 正向片段的连入RNAi载体 | 第32页 |
| 2.3.2.3 pHannibal-CI RNAi载体的的酶切验证 | 第32-33页 |
| 2.3.3 表达载体pBBBast-CI的构建 | 第33-34页 |
| 2.3.3.1 NotⅠ片段的酶切回收 | 第33页 |
| 2.3.3.2 表达载体的酶切验证 | 第33-34页 |
| 2.3.4 转基因拟南芥的筛选和鉴定 | 第34页 |
| 2.3.5 转基因纯合株系的初步鉴定 | 第34-36页 |
| 2.3.6 转基因植株的病情指数统计 | 第36页 |
| 2.3.7 转基因植株抗病的半定量分析 | 第36-37页 |
| 2.3.8 转基因植株抗病的相对定量分析 | 第37-38页 |
| 第三章 VPg基因的RNAi载体构建及抗病分析 | 第38-47页 |
| 3.1 试验材料 | 第38页 |
| 3.2 试验方法 | 第38-40页 |
| 3.2.1 VPg目的基因的克隆 | 第38页 |
| 3.2.2 pHannibal-VPg RNAi载体的构建 | 第38-39页 |
| 3.2.2.1 反向片段连入RNAi载体 | 第38-39页 |
| 3.2.2.2 正向片段的连接 | 第39页 |
| 3.2.2.3 pHannibal-VPg RNAi载体的酶切验证 | 第39页 |
| 3.2.3 植物表达载体pBBBast-VPg的构建 | 第39页 |
| 3.2.3.1 目的NotⅠ片段的酶切 | 第39页 |
| 3.2.3.2 载体片段酶切 | 第39页 |
| 3.2.3.3 目的片段与载体连接 | 第39页 |
| 3.2.4 拟南芥的遗传转化及转基因阳性苗的筛选和鉴定 | 第39-40页 |
| 3.2.5 转基因拟南芥单拷贝基因的初步鉴定 | 第40页 |
| 3.2.6 转基因植株病情指数统计 | 第40页 |
| 3.2.7 转基因植株抗病的半定量分析和相对定量分析 | 第40页 |
| 3.3 结果与分析 | 第40-47页 |
| 3.3.1 VPg目的基因的获得 | 第40页 |
| 3.3.2 pHannibal-VPg RNAi载体的构建 | 第40-42页 |
| 3.3.2.1 反向片段连入RNAi载体 | 第40-41页 |
| 3.3.2.2 正向片段的连接 | 第41页 |
| 3.3.2.3 pHannibal-VPg RNAi载体的酶切验证 | 第41-42页 |
| 3.3.3 植物表达载体pBBBast-VPg的构建 | 第42-43页 |
| 3.3.3.1 NotⅠ片段的酶切回收 | 第42页 |
| 3.3.3.2 表达载体的MluI酶切验证 | 第42-43页 |
| 3.3.4 转基因拟南芥的筛选和鉴定 | 第43页 |
| 3.3.5 转基因纯合株系的初步鉴定 | 第43-45页 |
| 3.3.6 转基因植株的病情指数统计 | 第45页 |
| 3.3.7 转基因植株抗病的半定量分析 | 第45-46页 |
| 3.3.8 转基因植株抗病的相对定量分析 | 第46-47页 |
| 第四章 HC-Pro基因的RNAi载体构建及抗病分析 | 第47-54页 |
| 4.1 试验材料 | 第47页 |
| 4.2 试验方法 | 第47页 |
| 4.2.1 HC-Pro目的基因的克隆 | 第47页 |
| 4.3 结果与分析 | 第47-54页 |
| 4.3.1 HC-Pro目的基因的获得 | 第47页 |
| 4.3.2 pHannnibal-HC-pro RNAi载体的构建 | 第47-49页 |
| 4.3.2.1 反向片段连入RNAi载体 | 第47-48页 |
| 4.3.2.2 正向片段的连接 | 第48页 |
| 4.3.2.3 RNAi载体的的酶切验证 | 第48-49页 |
| 4.3.3 植物表达载体pBBBast-HC-Pro的构建 | 第49-50页 |
| 4.3.3.1 NotⅠ片段的酶切回收 | 第49页 |
| 4.3.3.2 表达载体的MluⅠ酶切验证 | 第49-50页 |
| 4.3.4 转基因拟南芥的筛选和鉴定 | 第50页 |
| 4.3.5 转基因纯合株系的初步鉴定 | 第50-51页 |
| 4.3.6 转基因植株的病情指数统计 | 第51-52页 |
| 4.3.7 转基因植株抗病的半定量分析 | 第52页 |
| 4.3.8 转基因植株抗病的相对定量分析 | 第52-54页 |
| 第五章 TuMV全基因组测序结果与分析 | 第54-65页 |
| 5.1 试验材料 | 第54页 |
| 5.1.1 病毒分离物 | 第54页 |
| 5.1.2 酶与试剂 | 第54页 |
| 5.2 试验方法 | 第54-58页 |
| 5.2.1 总RNA的提取 | 第54页 |
| 5.2.2 cDNA第一链合成 | 第54页 |
| 5.2.3 TuMV基因组分段基因的扩增 | 第54-55页 |
| 5.2.4 3'cDNA末端扩增(3,RACE) | 第55-56页 |
| 5.2.5 5'cDNA末端扩增(5'RACE) | 第56-57页 |
| 5.2.5 扩增产物的克隆和序列测定 | 第57页 |
| 5.2.6 TuMV全基因序列的确定和分析 | 第57页 |
| 5.2.7 宿主致病性鉴定 | 第57-58页 |
| 5.3 结果与分析 | 第58-65页 |
| 5.3.1 分段基因的扩增与确定 | 第58-59页 |
| 5.3.2 3'末端扩增(3'RACE) | 第59页 |
| 5.3.3 5'末端扩增(5'RACE) | 第59-60页 |
| 5.3.4 TuMV全基因组的同源性比较 | 第60页 |
| 5.3.5 系统进化树分析 | 第60-63页 |
| 5.3.6 分离物的致病型分析 | 第63-65页 |
| 第六章 简化一步多重RT-PCR法快速检测芜菁花叶病毒 | 第65-72页 |
| 6.1 试验材料 | 第65-66页 |
| 6.1.1 病毒分离物 | 第65-66页 |
| 6.1.2 酶与试剂 | 第66页 |
| 6.2 试验方法 | 第66-67页 |
| 6.2.1 引物设计 | 第66页 |
| 6.2.2 病毒RNA的获取 | 第66页 |
| 6.2.3 一步法RT-PCR | 第66-67页 |
| 6.2.4 扩增产物检测 | 第67页 |
| 6.3 结果分析 | 第67-72页 |
| 6.3.1 不同引物对检测效果的影响 | 第67-68页 |
| 6.3.2 病毒量对扩增效率的影响 | 第68-70页 |
| 6.3.3 检测结果与准确性 | 第70-71页 |
| 6.3.4 一步多重RT-PCR法检测 | 第71-72页 |
| 第七章 结论与讨论 | 第72-76页 |
| 7.1 结论 | 第72页 |
| 7.2 讨论 | 第72-76页 |
| 参考文献 | 第76-83页 |
| 致谢 | 第83-84页 |
| 附录一 | 第84-89页 |
| 附录二 | 第89-94页 |
| 附录三 | 第94-99页 |
| 附录四 | 第99-103页 |
