| 学位论文数据集 | 第3-4页 |
| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-7页 |
| 符号说明 | 第13-14页 |
| 第一章 文献综述 | 第14-32页 |
| 1.1 1,3-丙二醇概况 | 第14-16页 |
| 1.1.1 1,3-丙二醇的理化性质 | 第14页 |
| 1.1.2 1,3-丙二醇的用途 | 第14-15页 |
| 1.1.3 1,3-丙二醇的生产方法 | 第15-16页 |
| 1.2 微生物发酵生产1,3-丙二醇 | 第16-28页 |
| 1.2.1 产生1,3-丙二醇的微生物 | 第16页 |
| 1.2.2 1,3-丙二醇的代谢途径 | 第16-18页 |
| 1.2.3 1,3-丙二醇代谢中的关键酶及基因 | 第18-23页 |
| 1.2.3.1 甘油脱水酶(GDHt) | 第19-21页 |
| 1.2.3.2 甘油脱水酶再激活酶 | 第21-22页 |
| 1.2.3.3 1,3-PD氧化还原酶(PDOR) | 第22-23页 |
| 1.2.3.4 甘油脱氢酶(GDH) | 第23页 |
| 1.2.3.5 二羟基丙酮激酶(DHAK) | 第23页 |
| 1.2.4 1,3-丙二醇的发酵生产 | 第23-25页 |
| 1.2.4.1 菌株筛选 | 第23-24页 |
| 1.2.4.2 发酵工艺 | 第24-25页 |
| 1.2.5 产1,3-丙二醇基因工程菌的研究 | 第25-28页 |
| 1.2.5.1 基因工程菌的构建策略 | 第25-26页 |
| 1.2.5.2 甘油转化1,3-丙二醇 | 第26-27页 |
| 1.2.5.3 葡萄糖转化1,3-丙二醇 | 第27页 |
| 1.2.5.4 副产物途径的敲除 | 第27-28页 |
| 1.3 1,3-丙二醇氧化还原酶的研究 | 第28-31页 |
| 1.3.1 1,3-PD氧化还原酶的性质 | 第28-29页 |
| 1.3.2 1,3-PD氧化还原酶的基因工程 | 第29页 |
| 1.3.3 1,3-PD氧化还原酶的高级结构预测 | 第29-30页 |
| 1.3.4 1,3-PD氧化还原酶的同功酶 | 第30-31页 |
| 1.4 存在的问题及展望 | 第31页 |
| 1.5 本实验的目的和意义 | 第31-32页 |
| 第二章 克雷伯肺炎杆菌1,3-丙二醇氧化还原酶基因的克隆和表达 | 第32-54页 |
| 2.1 引言 | 第32页 |
| 2.2 实验材料 | 第32-34页 |
| 2.2.1 菌株、质粒和引物 | 第32-33页 |
| 2.2.2 培养基 | 第33-34页 |
| 2.2.3 试剂和仪器 | 第34页 |
| 2.3 实验方法 | 第34-46页 |
| 2.3.1 培养方法 | 第34-35页 |
| 2.3.2 K.pneumoniae基因组DNA的提取 | 第35-36页 |
| 2.3.3 聚合酶链式反应扩增基因dhaT | 第36页 |
| 2.3.4 琼脂糖凝胶电泳鉴定和分离基因dhaT | 第36-37页 |
| 2.3.5 质粒pMD 18-T-dhaT的构建 | 第37-38页 |
| 2.3.6 质粒pMD 18-T-dhaT转化大肠杆菌 | 第38-39页 |
| 2.3.6.1 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第38页 |
| 2.3.6.2 连接产物的乙醇沉淀 | 第38-39页 |
| 2.3.6.3 重组质粒电击转化大肠杆菌 | 第39页 |
| 2.3.7 质粒pMD 18-T-dhaT的鉴定 | 第39-41页 |
| 2.3.7.1 蓝白斑筛选阳性重组子 | 第39-40页 |
| 2.3.7.2 质粒的酶切鉴定 | 第40页 |
| 2.3.7.3 序列测定和分析 | 第40-41页 |
| 2.3.8 质粒pET-28a-dhaT和pET-22b-dhaT的构建 | 第41页 |
| 2.3.9 质粒pET-28a-dhaT和pET-22b-dhaT的鉴定 | 第41-42页 |
| 2.3.9.1 菌落PCR筛选阳性重组子 | 第41-42页 |
| 2.3.9.2 酶切鉴定 | 第42页 |
| 2.3.9.3 序列测定和分析 | 第42页 |
| 2.3.10 基因dhaT在大肠杆菌的表达 | 第42-46页 |
| 2.3.10.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定重组蛋白 | 第42-44页 |
| 2.3.10.2 1,3-丙二醇氧化还原酶的活性测定 | 第44页 |
| 2.3.10.3 诱导时间的选择 | 第44页 |
| 2.3.10.4 诱导剂的选择 | 第44-45页 |
| 2.3.10.5 蛋白表达部位的确定 | 第45-46页 |
| 2.3.10.6 诱导温度对1,3-丙二醇氧化还原酶活性的影响 | 第46页 |
| 2.4 结果和讨论 | 第46-53页 |
| 2.4.1 K.pneumoniae基因组DNA的提取 | 第46页 |
| 2.4.2 聚合酶链式反应扩增基因dhaT | 第46-47页 |
| 2.4.3 质粒pMD 18-T-dhaT的鉴定 | 第47-48页 |
| 2.4.3.1 双酶切鉴定 | 第47页 |
| 2.4.3.2 序列测定和分析 | 第47-48页 |
| 2.4.4 质粒pET-28a-dhaT和pET-22b-dhaT的鉴定 | 第48-49页 |
| 2.4.4.1 菌落PCR | 第48页 |
| 2.4.4.2 双酶切鉴定 | 第48-49页 |
| 2.4.4.3 序列测定和分析 | 第49页 |
| 2.4.5 基因dhaT在大肠杆菌的表达 | 第49-53页 |
| 2.4.5.1 诱导时间的选择 | 第49-50页 |
| 2.4.5.2 诱导剂的选择 | 第50-51页 |
| 2.4.5.3 蛋白表达部位的确定 | 第51-52页 |
| 2.4.5.4 诱导温度对1,3-丙二醇氧化还原酶活性的影响 | 第52-53页 |
| 2.5 小结 | 第53-54页 |
| 第三章 1,3-丙二醇氧化还原酶与甘油脱水酶的共表达 | 第54-67页 |
| 3.1 引言 | 第54页 |
| 3.2 实验材料 | 第54-56页 |
| 3.2.1 菌株、质粒和引物 | 第54-55页 |
| 3.2.2 培养基 | 第55页 |
| 3.2.3 试剂和仪器 | 第55-56页 |
| 3.3 实验方法 | 第56-61页 |
| 3.3.1 质粒pET-28a-dhaB1B2B3-dhaT的构建 | 第56-57页 |
| 3.3.2 质粒pET-28a-dhaB1B2B3-dhaT的鉴定 | 第57-58页 |
| 3.3.2.1 质粒的酶切鉴定 | 第57页 |
| 3.3.2.2 序列测定和分析 | 第57-58页 |
| 3.3.3 双质粒共转化大肠杆菌 | 第58页 |
| 3.3.4 1,3-丙二醇氧化还原酶和甘油脱水酶的共表达 | 第58页 |
| 3.3.5 双质粒在大肠杆菌共存的稳定性测定 | 第58页 |
| 3.3.6 1,3-丙二醇氧化还原酶和甘油脱水酶的活性测定 | 第58-59页 |
| 3.3.7 重组大肠杆菌转化甘油生成1,3-丙二醇 | 第59-61页 |
| 3.3.7.1 发酵液中甘油的测定方法-高碘酸钠氧化法 | 第59页 |
| 3.3.7.2 高效液相色谱测定产物浓度 | 第59-60页 |
| 3.3.7.3 摇瓶发酵 | 第60页 |
| 3.3.7.4 5L发酵罐的批式流加发酵 | 第60-61页 |
| 3.4 结果和讨论 | 第61-66页 |
| 3.4.1 质粒pET-28a-dhaB1B2B3-dhaT的鉴定 | 第61页 |
| 3.4.1.1 质粒的酶切鉴定 | 第61页 |
| 3.4.1.2 序列测定和分析 | 第61页 |
| 3.4.2 双质粒共转化大肠杆菌的酶切鉴定 | 第61-62页 |
| 3.4.3 1,3-丙二醇氧化还原酶和甘油脱水酶的共表达 | 第62-63页 |
| 3.4.4 双质粒在大肠杆菌共存的稳定性 | 第63页 |
| 3.4.5 1,3-丙二醇氧化还原酶和甘油脱水酶的活性分析 | 第63-64页 |
| 3.4.6 重组大肠杆菌转化甘油生成1,3-丙二醇 | 第64-66页 |
| 3.4.6.1 重组大肠杆菌的摇瓶发酵 | 第64-65页 |
| 3.4.6.2 重组大肠杆菌在5L发酵罐的发酵 | 第65-66页 |
| 3.5 小结 | 第66-67页 |
| 第四章 1,3-丙二醇氧化还原酶在克雷伯肺炎杆菌的过量表达 | 第67-82页 |
| 4.1 引言 | 第67页 |
| 4.2 实验材料 | 第67-69页 |
| 4.2.1 菌株、质粒和引物 | 第67-68页 |
| 4.2.2 培养基 | 第68页 |
| 4.2.3 试剂和仪器 | 第68-69页 |
| 4.3 实验方法 | 第69-74页 |
| 4.3.1 大肠杆菌质粒在克雷伯肺炎杆菌中的复制 | 第69页 |
| 4.3.1.1 克雷伯肺炎杆菌感受态细胞的制备 | 第69页 |
| 4.3.1.2 重组质粒电击转化克雷伯肺炎杆菌 | 第69页 |
| 4.3.1.3 重组质粒在克雷伯肺炎杆菌复制的鉴定 | 第69页 |
| 4.3.2 克雷伯肺炎杆菌启动子序列的克隆 | 第69-72页 |
| 4.3.2.1 PCR扩增Pk | 第71页 |
| 4.3.2.2 质粒pMD 18-T-Pk的构建 | 第71-72页 |
| 4.3.2.3 序列测定和分析 | 第72页 |
| 4.3.3 质粒pPk-dhaB1B2B3-dhaT的构建和鉴定 | 第72页 |
| 4.3.4 1,3-丙二醇氧化还原酶和甘油脱水酶在克雷伯肺炎杆菌的过量表达 | 第72页 |
| 4.3.5 质粒pPk-dhaT的构建和鉴定 | 第72-73页 |
| 4.3.6 1,3-丙二醇氧化还原酶在克雷伯肺炎杆菌的过量表达 | 第73页 |
| 4.3.7 1,3-丙二醇氧化还原酶和甘油脱水酶的活性分析 | 第73页 |
| 4.3.8 重组克雷伯肺炎杆菌转化甘油生成1,3-丙二醇 | 第73-74页 |
| 4.3.8.1 气相色谱测定产物浓度 | 第73-74页 |
| 4.3.8.2 摇瓶发酵 | 第74页 |
| 4.3.8.3 5L发酵罐的批式流加发酵 | 第74页 |
| 4.4 结果和讨论 | 第74-81页 |
| 4.4.1 大肠杆菌质粒在克雷伯肺炎杆菌的复制 | 第74-75页 |
| 4.4.2 克雷伯肺炎杆菌启动子序列的克隆 | 第75-76页 |
| 4.4.2.1 PCR扩增Pk | 第75页 |
| 4.4.2.2 质粒pMD 18-T-Pk的构建 | 第75-76页 |
| 4.4.2.3 序列测定和分析 | 第76页 |
| 4.4.3 质粒pPk-dhaB1B2B3-dhaT的构建和鉴定 | 第76页 |
| 4.4.4 1,3-丙二醇氧化还原酶和甘油脱水酶在克雷伯肺炎杆菌的过量共表达 | 第76-77页 |
| 4.4.5 质粒pPk-dhaT的构建和鉴定 | 第77页 |
| 4.4.6 1,3-丙二醇氧化还原酶在克雷伯肺炎杆菌的过量表达 | 第77-78页 |
| 4.4.7 1,3-丙二醇氧化还原酶和甘油脱水酶的活性分析 | 第78-79页 |
| 4.4.8 重组克雷伯肺炎杆菌转化甘油生成1,3-丙二醇 | 第79-81页 |
| 4.4.8.1 重组克雷伯肺炎杆菌的摇瓶发酵 | 第79-80页 |
| 4.4.8.2 重组克雷伯肺炎杆菌在5L发酵罐的批式流加发酵 | 第80-81页 |
| 4.5 小结 | 第81-82页 |
| 第五章 结论 | 第82-83页 |
| 第六章 问题与建议 | 第83-84页 |
| 参考文献 | 第84-89页 |
| 附录一 试剂 | 第89-90页 |
| 附录二 仪器设备 | 第90-92页 |
| 致谢 | 第92-93页 |
| 研究成果及发表的学术论文 | 第93-94页 |
| 作者和导师简介 | 第94-95页 |
| 附件 | 第95-96页 |
