| 摘要 | 第3-4页 |
| Abstract | 第4-5页 |
| 1 前言 | 第11-33页 |
| 1.1 功能性低聚糖研究进展 | 第11-21页 |
| 1.1.1 低聚糖的功能 | 第11-13页 |
| 1.1.2 常见功能性低聚糖的种类 | 第13-14页 |
| 1.1.3 功能性低聚糖的应用 | 第14-15页 |
| 1.1.4 合成方式 | 第15-21页 |
| 1.2 蛋氨酸研究进展 | 第21-30页 |
| 1.2.1 蛋氨酸的性质 | 第21-22页 |
| 1.2.2 生理功能 | 第22-23页 |
| 1.2.3 吸收与代谢途径 | 第23-26页 |
| 1.2.4 蛋氨酸的应用 | 第26-27页 |
| 1.2.5 蛋氨酸生产 | 第27-29页 |
| 1.2.6 高产蛋氨酸菌株的构建 | 第29-30页 |
| 1.3 功能基因的挖掘 | 第30-32页 |
| 1.3.1 基因组学介绍 | 第31页 |
| 1.3.2 乳酸菌基因组学研究 | 第31-32页 |
| 1.4 本研究的目的和意义 | 第32-33页 |
| 2 材料与方法 | 第33-59页 |
| 2.1 材料 | 第33-37页 |
| 2.1.1 菌株和质粒 | 第33页 |
| 2.1.2 培养基及试剂配制 | 第33-35页 |
| 2.1.3 酶与试剂 | 第35-36页 |
| 2.1.4 主要仪器设备 | 第36页 |
| 2.1.5 试剂盒 | 第36页 |
| 2.1.6 分子量标准 | 第36-37页 |
| 2.2 方法 | 第37-59页 |
| 2.2.1 功能基因的挖掘 | 第37页 |
| 2.2.2 引物设计 | 第37-39页 |
| 2.2.3 ɑ-GTF-pla基因的克隆 | 第39-44页 |
| 2.2.4 ɑ-GTF-pla的表达表达验证 | 第44-53页 |
| 2.2.4.1 重组表达载体的构建 | 第44-47页 |
| 2.2.4.2 重组表达载体的转化E.coli DH5α | 第47页 |
| 2.2.4.3 重组表达载体的筛选与鉴定 | 第47-48页 |
| 2.2.4.4 重组表达载体转化 BL21 | 第48页 |
| 2.2.4.5 重组大肠杆菌的诱导表达 | 第48页 |
| 2.2.4.6 诱导表达产物SDS-PAGE分析 | 第48-49页 |
| 2.2.4.7 α-GTF酶活检测 | 第49-50页 |
| 2.2.4.8 重组蛋白含量的测定 | 第50页 |
| 2.2.4.9 诱导表达产物的纯化 | 第50页 |
| 2.2.4.10 包涵体复性 | 第50-51页 |
| 2.2.4.11 α-GTF-pla的表达条件优化 | 第51-52页 |
| 2.2.4.12 α-GTF-pla在乳酸乳球菌中的表达 | 第52-53页 |
| 2.2.5 α-GTF-cas的克隆与表达验证 | 第53-54页 |
| 2.2.6 α-GTF-bre的克隆与表达验证 | 第54页 |
| 2.2.7 FFase-pla的克隆及表达验证 | 第54-55页 |
| 2.2.8 RHL的克隆与表达验证 | 第55页 |
| 2.2.9 metA的克隆与表达验证 | 第55页 |
| 2.2.10 SPase在大肠杆菌中的表达验证 | 第55-57页 |
| 2.2.11 SPase合成功能性低聚糖研究 | 第57-59页 |
| 3 结果与分析 | 第59-101页 |
| 3.1 功能基因的挖掘 | 第59-61页 |
| 3.1.1 全基因组测序挖掘功能基因 | 第59-61页 |
| 3.1.2 数据库中 α-GTF的挖掘 | 第61页 |
| 3.2 引物设计 | 第61-62页 |
| 3.3 α-gtf-pla基因的克隆 | 第62-68页 |
| 3.3.1 植物乳杆菌基因组DNA的提取 | 第62页 |
| 3.3.2 α-GTF-pla的PCR扩增与产物检测 | 第62-63页 |
| 3.3.3 α-gtf-pla基因PCR产物的回收 | 第63页 |
| 3.3.4 植物乳杆菌 α-gtf-pla基因PCR产物测序 | 第63-64页 |
| 3.3.5 克隆载体 α-gtf-pla/pMD-18T构建与鉴定 | 第64页 |
| 3.3.6 α-gtf-pla完整序列的生物信息学分析 | 第64-68页 |
| 3.4 α-gtf-pla基因的表达验证 | 第68-73页 |
| 3.4.1 α-GTF-pla基因表达载体的构建与鉴定 | 第68-69页 |
| 3.4.2 α-GTF-pla基因的表达与分析 | 第69页 |
| 3.4.3 α-GTF-pla包涵体的复性 | 第69-70页 |
| 3.4.4 α-GTF-pla表达条件的优化 | 第70-71页 |
| 3.4.5 α-GTF-pla在乳酸乳球中的表达验证 | 第71-73页 |
| 3.5 α-gtf-cas基因的克隆与表达验证 | 第73-77页 |
| 3.5.1 干酪乳杆菌 α-GTF基因的克隆 | 第73-74页 |
| 3.5.2 表达载体 α-gtf-cas/pET-32a的构建 | 第74-75页 |
| 3.5.3 α-gtf-cas基因在大肠杆菌中的表达 | 第75-76页 |
| 3.5.4 表达载体 α-gtf-cas/pBM02的构建 | 第76-77页 |
| 3.6 α-gtf-bre基因的克隆与表达验证 | 第77-79页 |
| 3.6.1 α-gtf-bre基因的克隆 | 第77-78页 |
| 3.6.2 表达载体 α-gtf-bre/pET-32a的构建 | 第78页 |
| 3.6.3 α-gtf-bre基因在大肠杆菌中的表达验证 | 第78-79页 |
| 3.7 三株乳酸菌中 α-gtf基因的比较分析 | 第79-80页 |
| 3.8 FFase基因的克隆与表达验证 | 第80-83页 |
| 3.8.1 FFase基因的克隆 | 第80-81页 |
| 3.8.2 表达载体FFase/pET-32a的构建 | 第81-82页 |
| 3.8.3 FFase基因在大肠杆菌中的表达验证 | 第82-83页 |
| 3.9 RHL基因的克隆与表达验证 | 第83-85页 |
| 3.9.1 RHL基因的克隆 | 第83-84页 |
| 3.9.2 表达载体RHL/pET-32a的构建 | 第84页 |
| 3.9.3 RHL基因在大肠杆菌中的表达验证 | 第84-85页 |
| 3.10 MetA基因的克隆与表达验证 | 第85-87页 |
| 3.10.1 MetA基因的克隆 | 第85-86页 |
| 3.10.2 MetA基因表达载体MetA/pET-32a的构建 | 第86页 |
| 3.10.3 MetA基因在大肠杆菌中的表达验证 | 第86-87页 |
| 3.11 SPase基因的克隆与表达验证 | 第87-90页 |
| 3.11.1 SPase基因的克隆 | 第87-88页 |
| 3.11.2 表达载体SPase/pET-32a的构建 | 第88-89页 |
| 3.11.3 SPase基因在大肠杆菌中的表达验证 | 第89页 |
| 3.11.4 SPase的纯化分析 | 第89-90页 |
| 3.11.5 SPase酶活测定 | 第90页 |
| 3.12 SPase酶学性质研究 | 第90-94页 |
| 3.12.1 SPase最适反应温度 | 第90-91页 |
| 3.12.2 酶的最适反应pH | 第91页 |
| 3.12.3 金属离子对SPase酶活的影响 | 第91-92页 |
| 3.12.4 温度对SPase稳定性的影响 | 第92-93页 |
| 3.12.5 pH对SPase稳定性的影响 | 第93页 |
| 3.12.6 SPase酶反应常数测定 | 第93-94页 |
| 3.13 SPase合成功能性低聚糖 | 第94-101页 |
| 3.13.1 SPase合成功能性低聚糖底物的筛选 | 第94-95页 |
| 3.13.2 蜜二糖合成条件的影响 | 第95-98页 |
| 3.13.3 正交分析 | 第98-101页 |
| 4 讨论与结论 | 第101-108页 |
| 4.1 讨论 | 第101-107页 |
| 4.1.1 基因挖掘与验证 | 第101-102页 |
| 4.1.2 大肠杆菌表达系统中包涵体的形成 | 第102-104页 |
| 4.1.3 乳酸菌表达系统 | 第104-106页 |
| 4.1.4 SPase合成功能性低聚糖 | 第106-107页 |
| 4.2 结论 | 第107-108页 |
| 致谢 | 第108-109页 |
| 参考文献 | 第109-121页 |
| 附录 | 第121页 |
