| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-8页 |
| 第一章 文献综述 | 第14-24页 |
| 1.1 脂肪酶简介 | 第14页 |
| 1.2 脂肪酶的来源 | 第14-15页 |
| 1.2.1 动物脂肪酶 | 第15页 |
| 1.2.2 植物脂肪酶 | 第15页 |
| 1.2.3 微生物脂肪酶 | 第15页 |
| 1.3 脂肪酶的结构 | 第15-17页 |
| 1.4 脂肪酶催化机理与反应类型 | 第17页 |
| 1.5 脂肪酶的应用 | 第17-20页 |
| 1.5.1 应用于食品工业 | 第18页 |
| 1.5.2 应用于洗涤工业 | 第18页 |
| 1.5.3 应用于医药领域 | 第18-19页 |
| 1.5.4 应用于生物柴油的制取 | 第19-20页 |
| 1.6 微生物脂肪酶基因的研究 | 第20-21页 |
| 1.7 选题意义与目的 | 第21页 |
| 1.8 研究内容 | 第21-23页 |
| 1.9 技术路线 | 第23-24页 |
| 第二章 产脂肪酶菌株的筛选及鉴定 | 第24-33页 |
| 2.1 前言 | 第24-25页 |
| 2.2 材料 | 第25-26页 |
| 2.2.1 样品 | 第25页 |
| 2.2.2 主要使用的试剂 | 第25页 |
| 2.2.3 培养基及主要仪器设备 | 第25-26页 |
| 2.3 实验方法 | 第26-27页 |
| 2.3.1 脂肪酶产生菌的筛选 | 第26页 |
| 2.3.2 菌株分子生物学鉴定 | 第26-27页 |
| 2.3.2.1 基因组DNA的提取 | 第26页 |
| 2.3.2.2 16S rDNA的扩增与TA克隆 | 第26-27页 |
| 2.3.2.3 阳性克隆的筛选 | 第27页 |
| 2.3.2.4 系统发育树的构建与分析 | 第27页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第27-31页 |
| 2.4.1 脂肪酶产生菌的筛选结果 | 第27-28页 |
| 2.4.2 菌株分子生物学鉴定 | 第28-31页 |
| 2.4.2.1 菌株基因组DNA的提取和TA克隆 | 第28-29页 |
| 2.4.2.2 系统发育树的构建与分析 | 第29-31页 |
| 2.5 小结 | 第31-33页 |
| 第三章 脂肪酶基因的克隆表达 | 第33-60页 |
| 3.1 前言 | 第33-34页 |
| 3.2 材料 | 第34-37页 |
| 3.2.1 菌株和质粒 | 第34-36页 |
| 3.2.2 主要用酶和试剂 | 第36页 |
| 3.2.3 培养基和溶液 | 第36页 |
| 3.2.4 引物序列 | 第36-37页 |
| 3.2.5 仪器设备 | 第37页 |
| 3.3 实验方法 | 第37-46页 |
| 3.3.1 同源性检索和引物设计 | 第38页 |
| 3.3.2 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第38页 |
| 3.3.3 聚合酶链式反应(PCR)扩增目的基因 | 第38-40页 |
| 3.3.4 产物lip-T添加A碱基及TA克隆 | 第40-41页 |
| 3.3.5 测序结果生物信息学分析 | 第41页 |
| 3.3.6 质粒提取 | 第41页 |
| 3.3.7 核酸电泳 | 第41-42页 |
| 3.3.8 目的片段和质粒的双酶切 | 第42页 |
| 3.3.9 纯化酶切后的目的片段 | 第42-43页 |
| 3.3.10 目的片段与载体连接 | 第43页 |
| 3.3.11 转化连接产物 | 第43页 |
| 3.3.12 筛选阳性克隆转化子 | 第43页 |
| 3.3.13 转重组质粒到表达菌株 | 第43-44页 |
| 3.3.14 重组质粒的诱导表达 | 第44页 |
| 3.3.15 SDS-PAGE蛋白质电泳检测 | 第44页 |
| 3.3.16 酶活力测定 | 第44-45页 |
| 3.3.16.1 样品酶活测定 | 第44-45页 |
| 3.3.16.2 对硝基苯酚(pNP)标准曲线的制作 | 第45页 |
| 3.3.17 重组表达条件的优化 | 第45-46页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第46-58页 |
| 3.4.1 同源搜索与信号肽分析 | 第46-47页 |
| 3.4.2 基因的克隆与重组表达载体的构建 | 第47-55页 |
| 3.4.2.1 PCR产物 | 第48页 |
| 3.4.2.2 TA克隆重组质粒的筛选 | 第48页 |
| 3.4.2.3 测序结果及序列生物信息学分析 | 第48-53页 |
| 3.4.2.4 质粒的提取 | 第53页 |
| 3.4.2.5 目的片段和质粒双酶切 | 第53-54页 |
| 3.4.2.6 重组质粒的验证 | 第54-55页 |
| 3.4.3 酶活力初步测定 | 第55页 |
| 3.4.4 蛋白SDS-PAGE电泳 | 第55-57页 |
| 3.4.5 pNP标准曲线 | 第57页 |
| 3.4.6 表达条件的优化 | 第57-58页 |
| 3.5 小结 | 第58-60页 |
| 第四章 脂肪酶变复性与蛋白纯化 | 第60-69页 |
| 4.1 前言 | 第60-61页 |
| 4.2 材料 | 第61-62页 |
| 4.2.1 主要试剂和溶液 | 第61-62页 |
| 4.2.2 主要仪器 | 第62页 |
| 4.3 实验方法 | 第62-63页 |
| 4.3.1 JDLipaseL包涵体的获得 | 第62页 |
| 4.3.2 JDLipaseL包涵体变复性处理 | 第62页 |
| 4.3.3 镍柱处理 | 第62页 |
| 4.3.4 JDLipaseL包涵体复性蛋白的纯化 | 第62-63页 |
| 4.3.4.1 纯化条件的摸索 | 第62-63页 |
| 4.3.4.2 纯化 | 第63页 |
| 4.3.4.3 脱盐浓缩 | 第63页 |
| 4.3.4.4 蛋白含量的测定 | 第63页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第63-67页 |
| 4.4.1 Nano Drop 2000C测JDLipaseL包涵体溶解后蛋白浓度 | 第63-64页 |
| 4.4.2 洗脱条件的优化 | 第64-66页 |
| 4.4.3 纯化结果 | 第66-67页 |
| 4.4.4 蛋白含量标准曲线 | 第67页 |
| 4.5 小结 | 第67-69页 |
| 第五章 脂肪酶酶学性质 | 第69-79页 |
| 5.1 前言 | 第69页 |
| 5.2 材料 | 第69-70页 |
| 5.2.1 试剂 | 第69页 |
| 5.2.2 主要缓冲液 | 第69页 |
| 5.2.3 仪器设备 | 第69-70页 |
| 5.3 实验方法 | 第70-73页 |
| 5.3.1 脂肪酶酶活力的测定 | 第70页 |
| 5.3.2 最适反应pH的测定 | 第70页 |
| 5.3.3 最适反应温度的测定 | 第70页 |
| 5.3.4 底物特异性分析 | 第70-71页 |
| 5.3.5 酶促动力学性质的测定 | 第71页 |
| 5.3.6 金属离子对酶活力的影响 | 第71-72页 |
| 5.3.7 有机溶剂对酶活力的影响 | 第72页 |
| 5.3.8 不同浓度甲醇对酶活力的影响 | 第72-73页 |
| 5.4 结果与讨论 | 第73-78页 |
| 5.4.1 酶活力测定 | 第73页 |
| 5.4.2 脂肪酶的最适反应pH | 第73-74页 |
| 5.4.3 脂肪酶的最适反应温度 | 第74页 |
| 5.4.4 脂肪酶的底物特异性分析 | 第74-75页 |
| 5.4.5 脂肪酶的酶促动力学性质 | 第75-76页 |
| 5.4.6 金属离子对脂肪酶的影响 | 第76页 |
| 5.4.7 有机溶剂对脂肪酶的影响 | 第76-77页 |
| 5.4.8 不同浓度的甲醇对脂肪酶的影响 | 第77-78页 |
| 5.5 小结 | 第78-79页 |
| 第六章 全文总结 | 第79-81页 |
| 6.1 结论 | 第79-80页 |
| 6.2 问题与展望 | 第80-81页 |
| 参考文献 | 第81-89页 |
| 附录 | 第89-96页 |
| 附录1 培养基、溶液和部分详细分子实验 | 第89-92页 |
| 附录2 仪器设备 | 第92-94页 |
| 附录3 计算机软件及网络资源 | 第94-95页 |
| 附录4 质粒序列和基因序列 | 第95-96页 |
| 致谢 | 第96-97页 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文目录 | 第97页 |
