| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-7页 |
| 前言 | 第13-15页 |
| 第1章 绪论 | 第15-23页 |
| 1.1 抗菌肽概述 | 第15页 |
| 1.2 鱼类抗菌肽的研究进展 | 第15-16页 |
| 1.3 Hepcidin的研究进展 | 第16-19页 |
| 1.3.1 Hepcidin的分子结构及其亚型 | 第16-17页 |
| 1.3.2 Hepcidin的抗菌作用 | 第17页 |
| 1.3.3 Hepcidin对铁稳态的调节 | 第17-19页 |
| 1.3.4 低氧对Hepcidin的表达 | 第19页 |
| 1.4 大肠杆菌表达系统 | 第19-20页 |
| 1.5 SUMO融合表达技术 | 第20-21页 |
| 1.6 金属鳌合亲和层析技术 | 第21页 |
| 1.7 本论文的研究目的及意义 | 第21-23页 |
| 第2章 bpHep-1 和bpHep-2 的分子克隆及序列分析 | 第23-53页 |
| 2.1 引言 | 第23页 |
| 2.2 材料与方法 | 第23-24页 |
| 2.2.1 实验动物 | 第23页 |
| 2.2.2 菌株与载体 | 第23页 |
| 2.2.3 试剂 | 第23页 |
| 2.2.4 培养基 | 第23-24页 |
| 2.2.5 主要仪器设备 | 第24页 |
| 2.3 方法 | 第24-34页 |
| 2.3.1 引物的设计与合成 | 第24-25页 |
| 2.3.2 大弹涂鱼肝脏基因组的提取 | 第25-26页 |
| 2.3.3 大弹涂鱼肝脏总RNA的提取 | 第26页 |
| 2.3.4 cDNA的合成 | 第26-27页 |
| 2.3.5 bpHep-1 和bpHep-2 基因扩增 | 第27-28页 |
| 2.3.6 构建pMD18-T载体，鉴定序列 | 第28-31页 |
| 2.3.6.1 连接pMD18-T载体 | 第28页 |
| 2.3.6.2 感受态细胞制作 | 第28-29页 |
| 2.3.6.3 转化 | 第29-30页 |
| 2.3.6.4 大肠杆菌转化子菌落PCR验证 | 第30页 |
| 2.3.6.5 质粒提取 | 第30-31页 |
| 2.3.6.6 测序结果验证 | 第31页 |
| 2.3.7 bpHep-1 和bpHep-2 基因序列的生物信息学分析 | 第31-34页 |
| 2.3.7.1 转录起始位点 | 第31页 |
| 2.3.7.2 启动子序列预测 | 第31页 |
| 2.3.7.3 转录因子结合位点预测 | 第31-32页 |
| 2.3.7.4 蛋白物理化学性质分析 | 第32页 |
| 2.3.7.5 分子系统学 | 第32-34页 |
| 2.4 实验结果与分析 | 第34-48页 |
| 2.4.1 大弹涂鱼肝脏基因组DNA提取及bpHep-1 和bpHep-2 基因扩增 | 第34-35页 |
| 2.4.2 大弹涂鱼肝脏RNA的提取及hepcidn两个亚型c DNA的扩增 | 第35-36页 |
| 2.4.3 bpHep-1 及bpHep-2 的氨基酸序列特征 | 第36-41页 |
| 2.4.4 分子系统学分析 | 第41-44页 |
| 2.4.5 bpHep-1 和bpHep-2 的转录起始位点 | 第44-45页 |
| 2.4.6 bpHep-1 和bpHep-2 基因特征 | 第45页 |
| 2.4.7 启动子、5’ 侧翼序列的转录因子结合位点分析 | 第45-48页 |
| 2.5 讨论 | 第48-51页 |
| 2.5.1 RACE技术 | 第48页 |
| 2.5.2 Hepcidin分子序列特征与进化分析 | 第48-50页 |
| 2.5.3 转录因子结合位点 | 第50-51页 |
| 2.5.4 Hepcidin基因组结构 | 第51页 |
| 2.6 本章小结 | 第51-53页 |
| 第3章 bpHep-1 和bpHep-2 基因组织表达分析 | 第53-70页 |
| 3.1 前言 | 第53页 |
| 3.2 材料与方法 | 第53-54页 |
| 3.2.1 实验动物 | 第53页 |
| 3.2.2 试剂 | 第53页 |
| 3.2.3 主要仪器设备 | 第53-54页 |
| 3.3 方法 | 第54-58页 |
| 3.3.1 引物设计 | 第54页 |
| 3.3.2 弹涂鱼注射刺激物及组织取样 | 第54-55页 |
| 3.3.3 提取各组织的RNA | 第55页 |
| 3.3.4 cDNA的合成 | 第55-56页 |
| 3.3.4.1 去除基因组DNA | 第55-56页 |
| 3.3.4.2 反转录反应 | 第56页 |
| 3.3.5 半定量RT-PCR检测 | 第56-57页 |
| 3.3.6 荧光定量PCR检测bpHep-1 和bpHep-2 在不同刺激下的表达量 | 第57-58页 |
| 3.3.7 统计学分析 | 第58页 |
| 3.4 结果与分析 | 第58-67页 |
| 3.4.1 总RNA的质量检测 | 第58页 |
| 3.4.2 大弹涂鱼bpHep-1 和和bpHep-2 基因组织分布 | 第58-61页 |
| 3.4.3 腹腔注射刺激后大弹涂鱼Hepcidin基因的组织表达分布 | 第61-67页 |
| 3.4.3.1 肝脏 | 第61-62页 |
| 3.4.3.2 鳃 | 第62-63页 |
| 3.4.3.3 小肠 | 第63-64页 |
| 3.4.3.4 头肾 | 第64-66页 |
| 3.4.3.5 脾脏 | 第66-67页 |
| 3.5 讨论 | 第67-69页 |
| 3.6 本章小结 | 第69-70页 |
| 第4章 bpHep-1 和bpHep-2 基因的原核表达 | 第70-90页 |
| 4.1 引言 | 第70页 |
| 4.2 材料与方法 | 第70-72页 |
| 4.2.1 实验动物 | 第70页 |
| 4.2.2 菌株与ULP | 第70页 |
| 4.2.3 试剂 | 第70页 |
| 4.2.4 培养基和试剂配方 | 第70-72页 |
| 4.2.5 主要仪器设备 | 第72页 |
| 4.3 方法 | 第72-79页 |
| 4.3.1 bpHep-1 和bpHep-2 成熟肽引物设计 | 第72-73页 |
| 4.3.2 RNA提取及c DNA的合成 | 第73页 |
| 4.3.3 PCR获取目的基因片段 | 第73-74页 |
| 4.3.4 连接pET-SUMO载体 | 第74-75页 |
| 4.3.5 连接产物转化BL21菌株测序鉴定重组子 | 第75-76页 |
| 4.3.6 IPTG诱导bpHep-1 和bpHep-2 菌株表达 | 第76页 |
| 4.3.7 诱导表达蛋白提取 | 第76页 |
| 4.3.8 总蛋白SDS-PAGE胶检测表达结果 | 第76-77页 |
| 4.3.9 亲和纯化目的蛋白 | 第77页 |
| 4.3.10 ULP酶切 | 第77页 |
| 4.3.11 纯化酶切蛋白 | 第77-78页 |
| 4.3.12 小分子蛋白凝胶Tris-Tricine PAGE检测目的蛋白 | 第78页 |
| 4.3.13 OD法抑菌实验 | 第78-79页 |
| 4.4 结果与分析 | 第79-87页 |
| 4.4.1 bpHep-1 和bpHep-2 成熟肽PCR | 第79-80页 |
| 4.4.2 bpHep-1 和bpHep-2 成熟肽基因重组子测序结果 | 第80-81页 |
| 4.4.3 bpHep-1 和bpHep-2 总蛋白 | 第81页 |
| 4.4.4 融合蛋白的分离纯化 | 第81-82页 |
| 4.4.5 融合蛋白酶切 | 第82-83页 |
| 4.4.7 OD法抑菌实验 | 第83-87页 |
| 4.5 讨论 | 第87-88页 |
| 4.6 本章小结 | 第88-90页 |
| 第5章 结论 | 第90-92页 |
| 5.1 主要研究结论 | 第90-91页 |
| 5.2 创新点 | 第91-92页 |
| 参考文献 | 第92-99页 |
| 附录 | 第99-103页 |
| 致谢 | 第103-104页 |
| 硕士期间学术成果 | 第104-106页 |
