| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 缩略词索引 | 第18-19页 |
| 第一章 前言 | 第19-39页 |
| 1.1 肺癌 | 第19-26页 |
| 1.1.1 肺癌的简介 | 第19页 |
| 1.1.2 肺癌的病因 | 第19-20页 |
| 1.1.3 肺癌的危害 | 第20页 |
| 1.1.4 肺癌与细胞周期 | 第20-22页 |
| 1.1.5 肺癌的治疗 | 第22-26页 |
| 1.2 C-RAF激酶 | 第26-30页 |
| 1.2.1 C-RAF激酶的结构 | 第27-28页 |
| 1.2.2 C-Raf激酶与细胞凋亡 | 第28页 |
| 1.2.3 C-Raf激酶与细胞周期 | 第28-29页 |
| 1.2.4 C-Raf激酶与细胞分化 | 第29页 |
| 1.2.5 C-Raf激酶与肿瘤 | 第29-30页 |
| 1.3 黏附素(Choesin)复合体 | 第30-31页 |
| 1.3.1 黏附素(Choesin)复合体的结构 | 第30页 |
| 1.3.2 黏附素(Choesin)复合体在细胞中的作用 | 第30-31页 |
| 1.3.3 黏附素(Choesin)复合体与癌症 | 第31页 |
| 1.4 染色体结构维持蛋白SMC3 | 第31-33页 |
| 1.4.1 SMC3的结构特点 | 第31-32页 |
| 1.4.2 SMC3的分子作用 | 第32页 |
| 1.4.3 SMC3的功能 | 第32-33页 |
| 1.5 蛋白磷酸酶PP2A | 第33-36页 |
| 1.5.1 PP2AAα的概述 | 第35-36页 |
| 1.5.2 PP2AAα与癌症 | 第36页 |
| 1.6 本文研究意义 | 第36-37页 |
| 1.7 实验方案与技术路线 | 第37-39页 |
| 第二章 用免疫沉淀法(CO-IP)和蛋白组学的方法系统识别C-Raf激酶的结合蛋白SMC3/PP2A Aα | 第39-51页 |
| 2.1 实验内容 | 第39-45页 |
| 2.1.1 实验方案 | 第39页 |
| 2.1.2 实验材料 | 第39-42页 |
| 2.1.3 实验方法 | 第42-44页 |
| 2.1.4 CO-IP实验检测C-Raf结合蛋白SMC3和PP2AAα | 第44页 |
| 2.1.5 Western blot验证SMC3/PP2AAα与C-Raf的结合情况 | 第44-45页 |
| 2.2 实验结果 | 第45-49页 |
| 2.2.1 C-Raf质谱结果分析 | 第45-48页 |
| 2.2.2 Wstern Blot检测SMC3/PP2AA蛋白与C-Raf结合情况 | 第48-49页 |
| 2.3 小结与讨论 | 第49-51页 |
| 第三章 构建高表达pcDNA3.1-SMC3和pcDNA3.1-PP2A Aα质粒 | 第51-69页 |
| 3.1 实验内容 | 第51-63页 |
| 3.1.1 实验方案 | 第51-52页 |
| 3.1.2 实验材料 | 第52-53页 |
| 3.1.3 实验方法 | 第53-55页 |
| 3.1.4 SMC3和PP2AAa的引物设计 | 第55页 |
| 3.1.5 普通PCR扩增目的片段SMC3和PP2A Aa | 第55-57页 |
| 3.1.6 琼脂糖凝胶电泳验证SMC3和PP2AAα的PCR结果 | 第57-58页 |
| 3.1.7 SMC3/PP2A Aα的PCR产物胶回收 | 第58页 |
| 3.1.8 SMC3/PP2AAa片段的限制性内切酶反应 | 第58-60页 |
| 3.1.9 连接Flag-SMC3/PP2A Aα和载体 | 第60-61页 |
| 3.1.10 转化pcDNA3.1-SMC3/PP2AAα | 第61-62页 |
| 3.1.11 挑克隆摇菌、验证 | 第62-63页 |
| 3.1.12 序列测序及对比 | 第63页 |
| 3.2 实验结果 | 第63-68页 |
| 3.2.1 琼脂糖凝胶电泳验证Flag-SMC3/ Flag PP2AAα的PCR效果 | 第63-64页 |
| 3.2.2 琼脂糖凝胶电泳验证酶切效果 | 第64页 |
| 3.2.3 菌落PCR验证 | 第64-65页 |
| 3.2.4 测序结果比对 | 第65-68页 |
| 3.3 小结与讨论 | 第68-69页 |
| 第四章 构建敲减pSUPER-SMC3和pSUPER-PP2A Aa质粒 | 第69-77页 |
| 4.1 实验内容 | 第69-74页 |
| 4.1.1 实验方案 | 第69-70页 |
| 4.1.2 实验材料 | 第70-71页 |
| 4.1.3 实验方法 | 第71页 |
| 4.1.4 引物设计 | 第71页 |
| 4.1.5 DNA片段的退火及延伸 | 第71-72页 |
| 4.1.6 酶切载体pSUPER | 第72页 |
| 4.1.7 连接反应 | 第72-73页 |
| 4.1.8 pSUPER-SMC3/PP2A Aα的转化 | 第73页 |
| 4.1.9 阳性敲减质粒的确认 | 第73-74页 |
| 4.2 实验结果 | 第74-76页 |
| 4.2.1 琼脂糖凝胶电泳验证载体PSUPER | 第74页 |
| 4.2.2 酶切验证 | 第74-75页 |
| 4.2.3 测序结果对比 | 第75-76页 |
| 4.3 小结与讨论 | 第76-77页 |
| 第五章 构建敲除px459-SMC3和px459-PP2A A α质粒 | 第77-85页 |
| 5.1 实验内容 | 第77-82页 |
| 5.1.1 实验方案 | 第77页 |
| 5.1.2 实验材料 | 第77-79页 |
| 5.1.3 实验方法 | 第79页 |
| 5.1.4 设计和合成SMC3和PP2AAα的sgRNA | 第79-80页 |
| 5.1.5 sgRNA- SMC3和sgRNA- PP2A Aα的磷酸化和退火 | 第80-81页 |
| 5.1.6 载体px459与PCR产物连接 | 第81页 |
| 5.1.7 PlasmidSafe exonuclease处理连接产物 | 第81-82页 |
| 5.1.8 px459-SMC3/PP2A Aα连接产物的转化 | 第82页 |
| 5.1.9 px459-SMC3/PP2A Aα挑克隆,摇菌,送测序 | 第82页 |
| 5.2 实验结果 | 第82-83页 |
| 5.3 小结与讨论 | 第83-85页 |
| 第六章 稳定细胞系的构建及验证 | 第85-103页 |
| 6.1 实验内容 | 第85-95页 |
| 6.1.1 实验方案 | 第85-86页 |
| 6.1.2 实验材料 | 第86-87页 |
| 6.1.3 实验方法 | 第87-89页 |
| 6.1.4 构建高表达、敲减和敲除稳定细胞系 | 第89-91页 |
| 6.1.5 挑取、扩培单克隆细胞 | 第91页 |
| 6.1.6 Western blotting检测SMC3和PP2AAα的表达 | 第91-93页 |
| 6.1.7 基因组水平验证A549-px459-SMC3敲除细胞 | 第93-95页 |
| 6.2 实验结果 | 第95-101页 |
| 6.2.1 Western blotting检测SMC3蛋白的表达效果 | 第95-97页 |
| 6.2.2 Western blotting检测PP2AAα蛋白的表达效果 | 第97-99页 |
| 6.2.3 SMC3敲除细胞系的基因验证 | 第99-101页 |
| 6.3 小结与讨论 | 第101-103页 |
| 第七章 下调SMC3蛋白的表达对A549细胞的功能研究 | 第103-117页 |
| 7.1 实验内容 | 第103-109页 |
| 7.1.1 实验方案 | 第103页 |
| 7.1.2 实验材料 | 第103-105页 |
| 7.1.3 实验方法 | 第105-106页 |
| 7.1.4 CCK8检测细胞增殖率 | 第106-107页 |
| 7.1.5 CCK8检测细胞的药物敏感性 | 第107页 |
| 7.1.6 划痕实验 | 第107-108页 |
| 7.1.7 Transwell小室实验 | 第108-109页 |
| 7.1.8 细胞成球实验 | 第109页 |
| 7.2 实验结果 | 第109-114页 |
| 7.2.1 下调SMC3蛋白的表达抑制A549细胞的增殖 | 第109-110页 |
| 7.2.2 下调SMC3蛋白的表达对A549细胞药物敏感性的影响 | 第110-111页 |
| 7.2.3 下调SMC3蛋白的表达对A549细胞迁移能力的影响 | 第111-112页 |
| 7.2.4 下调SMC3蛋白的表达对A549细胞迁移能力的影响 | 第112-113页 |
| 7.2.5 下调SMC3蛋白的表达对A549细胞成球能力的影响 | 第113-114页 |
| 7.3 小结与讨论 | 第114-117页 |
| 第八章 总结 | 第117-119页 |
| 致谢 | 第119-121页 |
| 参考文献 | 第121-127页 |
| 附录A SMC3编码基因序列 | 第127-129页 |
| 附录B PP2A A α编码基因序列 | 第129-131页 |
| 附录C 攻读硕士期间发表论文目录 | 第131页 |
