| 摘要 | 第10-12页 |
| 英文摘要 | 第12-13页 |
| 1 前言 | 第14-23页 |
| 1.1 奶牛乳腺发育与泌乳 | 第14-15页 |
| 1.2 奶牛乳蛋白合成机理及调控 | 第15页 |
| 1.3 MAP3K10激酶相关研究 | 第15-19页 |
| 1.3.1 蛋白激酶的分类和分子结构特征 | 第15-17页 |
| 1.3.2 MAP3K10激酶的功能研究 | 第17-19页 |
| 1.4 NFκB相关研究 | 第19-21页 |
| 1.4.1 NFκB的分类 | 第19-20页 |
| 1.4.2 NFκB的功能研究 | 第20-21页 |
| 1.5 氨酰tRNA合成酶的功能研究 | 第21-22页 |
| 1.5.1 氨酰t RNA合成酶的结构与功能 | 第21页 |
| 1.5.2 甘氨酰tRNA合成酶相关研究 | 第21-22页 |
| 1.6 实验目的与意义 | 第22-23页 |
| 2 材料与方法 | 第23-41页 |
| 2.1 实验材料 | 第23-27页 |
| 2.1.1 主要实验试剂 | 第23页 |
| 2.1.2 主要实验仪器 | 第23-24页 |
| 2.1.3 实验动物与细胞 | 第24页 |
| 2.1.4 主要溶液的配制 | 第24-27页 |
| 2.2 奶牛乳腺上皮细胞的培养纯化与鉴定 | 第27-30页 |
| 2.2.1 奶牛乳腺上皮细胞的原代培养与纯化 | 第27页 |
| 2.2.2 奶牛乳腺上皮细胞的鉴定 | 第27-29页 |
| 2.2.3 奶牛乳腺上皮细胞的冻存与复苏 | 第29-30页 |
| 2.3 Gly RS基因的原核诱导及蛋白纯化 | 第30-32页 |
| 2.3.1 RNA提取及反转录 | 第30页 |
| 2.3.2 Gly RS引物设计及PCR扩增 | 第30-31页 |
| 2.3.3 p-GEX-4T1Gly RS（GST-Gly RS）原核表达载体构建 | 第31页 |
| 2.3.4 重组蛋白诱导表达及纯化 | 第31-32页 |
| 2.4 p-MAP3K10与Gly RS的激酶反应 | 第32-34页 |
| 2.4.1 免疫共沉淀(Co-IP)分析p-MAP3K10与Gly RS的相互作用 | 第32-33页 |
| 2.4.2 p-MAP3K10激活Gly RS的激酶反应 | 第33-34页 |
| 2.4.3 p-MAP3K10在不同时间点激活Gly RS的激酶反应 | 第34页 |
| 2.5 NFκB1基因的原核诱导及蛋白纯化 | 第34-35页 |
| 2.5.1 RNA提取及反转录 | 第34页 |
| 2.5.2 NFκB1引物设计及PCR扩增 | 第34页 |
| 2.5.3 p-GEX-4T1NFκB1（GST-NFκB1）原核表达载体构建 | 第34页 |
| 2.5.4 重组蛋白诱导表达及纯化 | 第34-35页 |
| 2.6 p-Gly RS与NFκB1的激酶反应 | 第35-36页 |
| 2.6.1 免疫共沉淀(Co-IP)分析p-Gly RS与NFκB1的相互作用 | 第35页 |
| 2.6.2 Gly RS与NFκB1的激酶反应 | 第35页 |
| 2.6.3 p-Gly RS激活NFκB1的激酶反应 | 第35-36页 |
| 2.6.4 p-MAP3K10、GST-Gly RS、GST-NFκB1的连续激活反应 | 第36页 |
| 2.7 Gly RS基因的过表达载体构建及蛋白纯化 | 第36-39页 |
| 2.7.1 引物设计及PCR扩增 | 第36页 |
| 2.7.2 构建pCMV-C-Flag-Gly RS真核表达载体 | 第36-37页 |
| 2.7.3 重组质粒转染奶牛乳腺上皮细胞 | 第37页 |
| 2.7.4 胞浆蛋白和胞核蛋白的提取与纯度鉴定 | 第37页 |
| 2.7.5 Flag纯化试剂盒纯化p CMV-C-Flag-Gly RS | 第37-38页 |
| 2.7.6 磷酸化试剂盒进行二次纯化 | 第38-39页 |
| 2.8 纯化后的p-Gly RS蛋白与NFκB1激酶反应 | 第39-41页 |
| 3 结果与分析 | 第41-57页 |
| 3.1 乳腺上皮细胞的原代培养、纯化及其鉴定 | 第41-43页 |
| 3.1.1 乳腺上皮细胞的原代培养、纯化 | 第41-42页 |
| 3.1.2 乳腺上皮细胞的鉴定 | 第42-43页 |
| 3.2 Gly RS基因的原核诱导及蛋白纯化 | 第43-46页 |
| 3.2.1 RNA提取及反转录结果 | 第43页 |
| 3.2.2 Gly RS引物设计及PCR扩增结果 | 第43页 |
| 3.2.3 p-GEX-4T1Gly RS（GST-Gly RS）原核表达载体 | 第43-45页 |
| 3.2.4 重组蛋白诱导表达及纯化结果 | 第45-46页 |
| 3.3 p-MAP3K10与Gly RS的激酶反应 | 第46-48页 |
| 3.3.1 免疫共沉淀(Co-IP)分析Gly RS与p-MAP3K10的相互作用验证 | 第46页 |
| 3.3.2 p-MAP3K10激活Gly RS的激酶反应 | 第46-47页 |
| 3.3.3 p-MAP3K10在不同时间点激活Gly RS的激酶反应 | 第47-48页 |
| 3.4 NFκB1基因的原核诱导及蛋白纯化 | 第48-51页 |
| 3.4.1 NFκB1引物设计及PCR扩增结果 | 第48页 |
| 3.4.2 p-GEX-4T1NFκB1（GST-NFκB1）原核表达载体 | 第48-49页 |
| 3.4.3 重组蛋白诱导表达及纯化结果 | 第49-51页 |
| 3.5 p-Gly RS与NFκB1的激酶反应 | 第51-53页 |
| 3.5.1 免疫共沉淀(Co-IP)分析p-Gly RS与NFκB1的相互作用验证 | 第51页 |
| 3.5.2 Gly RS与NFκB1的激酶反应结果 | 第51-52页 |
| 3.5.3 p-Gly RS激活NFκB1的激酶反应结果 | 第52页 |
| 3.5.4 p-MAP3K10、GST-Gly RS和GST-NFκB1的连续激活反应结果 | 第52-53页 |
| 3.6 Gly RS基因的过表达载体构建及蛋白纯化 | 第53-56页 |
| 3.6.1 引物设计及PCR扩增结果 | 第53页 |
| 3.6.2 p CMV-C-Flag-GlyRS真核表达载体 | 第53-54页 |
| 3.6.3 胞浆蛋白和胞核蛋白的提取与纯度鉴定结果 | 第54页 |
| 3.6.4 Flag纯化试剂盒纯化p CMV-C-Flag-Gly RS | 第54-55页 |
| 3.6.5 磷酸化试剂盒进行二次纯化结果 | 第55-56页 |
| 3.7 纯化后的p-Gly RS蛋白与NFκB1激酶反应结果 | 第56-57页 |
| 4 讨论 | 第57-62页 |
| 4.1 奶牛乳腺上皮细胞的原代培养、纯化、鉴定 | 第57页 |
| 4.2 p-MAP3K10激活Gly RS的激酶反应 | 第57-58页 |
| 4.3 p-Gly RS激活NFκB1的激酶反应 | 第58-60页 |
| 4.3.1 p-Gly RS直接激活NFκB1的激酶反应 | 第58-59页 |
| 4.3.2 p-MAP3K10、GST-Gly RS、GST-NFκB1连续激活反应 | 第59页 |
| 4.3.3 纯化后的p-Gly RS蛋白与NFκB1激酶反应 | 第59-60页 |
| 4.3.4 Gly RS是激酶的可能分子结构基础 | 第60页 |
| 4.4 Gly RS相关新的信号通路的生物学意义 | 第60-62页 |
| 5 结论 | 第62-63页 |
| 致谢 | 第63-64页 |
| 参考文献 | 第64-72页 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 | 第72页 |
