| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 第1章 引言 | 第11-29页 |
| 1.1 单链结合蛋白 | 第11-20页 |
| 1.1.1 单链结合蛋白简介 | 第11页 |
| 1.1.2 ecSSB蛋白简介 | 第11-14页 |
| 1.1.3 ecSSB蛋白在DNA复制中的作用 | 第14-16页 |
| 1.1.4 ecSSB蛋白在DNA重组中的作用 | 第16-18页 |
| 1.1.5 ecSSB蛋白在DNA修复中的作用 | 第18-19页 |
| 1.1.6 ecSSB蛋白在分子生物学中的应用 | 第19-20页 |
| 1.2 HU蛋白 | 第20-22页 |
| 1.2.1 拟核结合蛋白简介 | 第20-21页 |
| 1.2.2 大肠杆菌HU蛋白简介 | 第21页 |
| 1.2.3 HU蛋白与DNA的互相作用 | 第21-22页 |
| 1.2.4 HU蛋白的功能 | 第22页 |
| 1.3 Fis蛋白 | 第22-24页 |
| 1.3.1 Fis蛋白简介 | 第22-23页 |
| 1.3.2 Fis蛋白与DNA的互相作用 | 第23页 |
| 1.3.3 Fis蛋白的功能 | 第23-24页 |
| 1.4 现有DNA结合蛋白的纯化方法 | 第24-26页 |
| 1.4.1 离子交换层析 | 第24页 |
| 1.4.2 基因工程构建纯化标记 | 第24页 |
| 1.4.3 亲和层析 | 第24-26页 |
| 1.5 DNA结合蛋白无柱式纯化研究背景 | 第26-28页 |
| 1.5.1 聚乙烯亚胺 | 第26页 |
| 1.5.2 硫酸铵 | 第26-27页 |
| 1.5.3 利用聚乙烯亚胺和硫酸铵进行纯化的三种方案 | 第27-28页 |
| 1.6 立题依据及研究内容 | 第28-29页 |
| 第2章 大肠杆菌单链DNA结合蛋白ecSSB-His的表达、纯化及活性鉴定 | 第29-56页 |
| 2.1 实验材料 | 第29-36页 |
| 2.1.1 菌株与载体 | 第29页 |
| 2.1.2 实验仪器 | 第29-30页 |
| 2.1.3 实验试剂与试剂盒 | 第30-32页 |
| 2.1.4 溶液及培养基的配制 | 第32-36页 |
| 2.2 载体构建、引物合成、转化及鉴定 | 第36-38页 |
| 2.2.1 pET22b-ecSSB-His表达载体构建 | 第36-37页 |
| 2.2.2 引物设计 | 第37页 |
| 2.2.3 pET22b-ecSSB-His重组质粒的转化 | 第37页 |
| 2.2.4 菌落PCR鉴定pET22b-ecSSB-His阳性克隆 | 第37-38页 |
| 2.2.5 测序 | 第38页 |
| 2.3 ecSSB-His蛋白的诱导、表达 | 第38-39页 |
| 2.3.1 以IPTG为诱导剂进行诱导 | 第38页 |
| 2.3.2 ecSSB-His蛋白表达的检测 | 第38-39页 |
| 2.4 ecSSB-His蛋白的无柱式纯化 | 第39-42页 |
| 2.4.1 样品总蛋白的提取 | 第39页 |
| 2.4.2 聚乙烯亚胺沉淀ecSSB-His蛋白 | 第39页 |
| 2.4.3 ecSSB-His蛋白从沉淀中洗脱 | 第39-40页 |
| 2.4.4 硫酸铵沉淀ecSSB-His蛋白 | 第40页 |
| 2.4.5 重悬硫酸铵沉淀并离心 | 第40-41页 |
| 2.4.6 透析 | 第41页 |
| 2.4.7 超滤 | 第41-42页 |
| 2.4.8 ecSSB蛋白的鉴定 | 第42页 |
| 2.5 ecSSB-His蛋白的活性鉴定 | 第42-43页 |
| 2.5.1 琼脂糖凝胶阻滞实验鉴定ecSSB-His蛋白的活性 | 第42页 |
| 2.5.2 核酸PAGE电泳检测ecSSB-His蛋白的活性 | 第42-43页 |
| 2.6 ecSSB-His蛋白的镍柱纯化 | 第43-44页 |
| 2.6.1 缓冲液及处理样品 | 第43页 |
| 2.6.2 纯化 | 第43-44页 |
| 2.6.3 透析和超滤 | 第44页 |
| 2.6.4 ecSSB蛋白的鉴定 | 第44页 |
| 2.7 结果与分析 | 第44-55页 |
| 2.7.1 菌落PCR鉴定 | 第44页 |
| 2.7.2 测序分析结果 | 第44-45页 |
| 2.7.3 ecSSB-His蛋白的诱导、表达 | 第45-46页 |
| 2.7.4 ecSSB-His蛋白的无柱式纯化条件筛选 | 第46-52页 |
| 2.7.5 ecSSB-His蛋白的活性鉴定 | 第52-53页 |
| 2.7.6 ecSSB-His蛋白的镍柱纯化 | 第53-55页 |
| 2.8 小结 | 第55-56页 |
| 第3章 大肠杆菌DNA结合蛋白HUβ-His的表达、纯化及活性鉴定 | 第56-73页 |
| 3.1 实验材料 | 第56-57页 |
| 3.1.1 菌株与载体 | 第56页 |
| 3.1.2 实验仪器 | 第56页 |
| 3.1.3 实验试剂 | 第56页 |
| 3.1.4 溶液及培养基的配置 | 第56-57页 |
| 3.2 载体构建、引物合成、转化及鉴定 | 第57-58页 |
| 3.2.1 pET22b-HUβ-His表达载体构建 | 第57页 |
| 3.2.2 引物设计 | 第57-58页 |
| 3.2.3 pET22b-HUβ-His重组质粒的转化 | 第58页 |
| 3.2.4 菌落PCR鉴定pET22b-HUβ-His阳性克隆 | 第58页 |
| 3.2.5 测序 | 第58页 |
| 3.3 HUβ-His蛋白的诱导、表达 | 第58-59页 |
| 3.3.1 以IPTG为诱导剂进行诱导 | 第58-59页 |
| 3.3.2 HUβ-His蛋白表达的检测 | 第59页 |
| 3.4 HUβ-His蛋白的无柱式纯化 | 第59-60页 |
| 3.4.1 滴定法判断沉淀核酸所需PEI的浓度 | 第59页 |
| 3.4.2 提取总蛋白时缓冲液NaCl浓度对PEI沉淀的影响 | 第59页 |
| 3.4.3 硫酸铵沉淀HUβ-His蛋白 | 第59-60页 |
| 3.4.4 透析和超滤 | 第60页 |
| 3.4.5 加热除去杂蛋白 | 第60页 |
| 3.5 HUβ-His蛋白的活性鉴定 | 第60-61页 |
| 3.5.1 HUβ-His蛋白与ssDNA的结合活性 | 第60-61页 |
| 3.5.2 HUβ-His蛋白与dsDNA的结合活性 | 第61页 |
| 3.6 HUβ-His蛋白的镍柱纯化 | 第61-62页 |
| 3.7 结果与分析 | 第62-72页 |
| 3.7.1 菌落PCR鉴定 | 第62页 |
| 3.7.2 测序分析 | 第62-63页 |
| 3.7.3 HUβ-His蛋白表达的检测 | 第63页 |
| 3.7.4 HUβ-His蛋白无柱式纯化条件筛选 | 第63-68页 |
| 3.7.5 HUβ-His蛋白与ssDNA的结合活性 | 第68-70页 |
| 3.7.6 HUβ-His蛋白与dsDNA的结合活性 | 第70-71页 |
| 3.7.7 HUβ-His蛋白的镍柱纯化 | 第71-72页 |
| 小结 | 第72-73页 |
| 第4章 大肠杆菌DNA结合蛋白Fis的表达、纯化及活性鉴定 | 第73-88页 |
| 4.1 实验材料 | 第73页 |
| 4.1.1 菌株与载体 | 第73页 |
| 4.1.2 实验仪器 | 第73页 |
| 4.1.3 实验试剂 | 第73页 |
| 4.1.4 溶液及培养基的配置 | 第73页 |
| 4.2 载体构建、引物合成、转化及鉴定 | 第73-78页 |
| 4.2.1 fis基因引物的设计 | 第73-74页 |
| 4.2.2 fis基因的合成 | 第74-76页 |
| 4.2.3 pET22b-Fis表达载体构建 | 第76-78页 |
| 4.2.4 菌落PCR鉴定pET22b-Fis阳性克隆 | 第78页 |
| 4.2.5 测序 | 第78页 |
| 4.3 Fis蛋白的诱导、表达 | 第78-79页 |
| 4.3.1 以IPTG为诱导剂进行诱导 | 第78页 |
| 4.3.2 Fis蛋白表达的检测 | 第78-79页 |
| 4.4 Fis蛋白的无柱式纯化 | 第79-80页 |
| 4.4.1 总蛋白的提取 | 第79页 |
| 4.4.2 滴定法判断沉淀核酸所需PEI的浓度 | 第79页 |
| 4.4.3 NaCl浓度对PEI沉淀的影响 | 第79页 |
| 4.4.4 硫酸铵沉淀Fis蛋白 | 第79页 |
| 4.4.5 透析和超滤 | 第79-80页 |
| 4.4.6 加热除去杂蛋白 | 第80页 |
| 4.5 Fis蛋白活性的鉴定 | 第80页 |
| 4.6 结果与分析 | 第80-87页 |
| 4.6.1 fis基因的合成 | 第80-81页 |
| 4.6.2 菌落PCR鉴定pET22b-Fis阳性克隆 | 第81-82页 |
| 4.6.3 测序分析 | 第82页 |
| 4.6.4 Fis蛋白表达的检测 | 第82-83页 |
| 4.6.5 Fis蛋白无柱式纯化条件筛选 | 第83-86页 |
| 4.6.6 Fis蛋白活性的鉴定 | 第86-87页 |
| 小结 | 第87-88页 |
| 第5章 总结 | 第88-90页 |
| 5.1 研究总结 | 第88-89页 |
| 5.2 创新点 | 第89-90页 |
| 参考文献 | 第90-96页 |
| 致谢 | 第96-97页 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果 | 第97页 |
