| 致谢 | 第4-9页 |
| 中文摘要 | 第9-10页 |
| 英文缩写词表 | 第10-11页 |
| 第一章 文献综述 | 第11-16页 |
| 1 猪繁殖与呼吸综合征病毒的分子生物学及纯化方法研究进展 | 第11-12页 |
| 1.1 猪繁殖与呼吸综合征病毒的分子生物学特征 | 第11-12页 |
| 1.1.1 PRRSV病原学 | 第11页 |
| 1.1.2 PRRSV分子生物学特征 | 第11-12页 |
| 1.2 猪繁殖与呼吸综合征病毒的纯化方法研究进展 | 第12页 |
| 2 猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体的研究进展 | 第12-14页 |
| 2.1 单克隆抗体概述 | 第12页 |
| 2.2 单抗在生物学研究中的应用 | 第12页 |
| 2.3 抗PRRSV单克隆抗体研究进展 | 第12-14页 |
| 2.3.1 抗N蛋白的单抗 | 第13页 |
| 2.3.2 抗GP5蛋白的单抗 | 第13页 |
| 2.3.3 抗M蛋白单抗 | 第13页 |
| 2.3.4 抗GP4蛋白的单抗 | 第13-14页 |
| 2.3.5 抗GP2和GP3蛋白单克隆抗体 | 第14页 |
| 3 猪繁殖与呼吸综合征病毒检测方法研究进展 | 第14-15页 |
| 3.1 免疫荧光实验（IFA） | 第14页 |
| 3.2 免疫过氧化物酶单层细胞试验（IPMA） | 第14页 |
| 3.3 酶联免疫吸附实验(ELISA) | 第14-15页 |
| 4 本研究的意义 | 第15-16页 |
| 第二章 猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株HN07-1 纯化方法的建立 | 第16-25页 |
| 1 材料与方法 | 第16-19页 |
| 1.1 病毒株、细胞及小鼠 | 第16页 |
| 1.2 主要试剂 | 第16页 |
| 1.3 仪器设备 | 第16-17页 |
| 1.4 病毒的增殖与制备 | 第17-18页 |
| 1.5 浓缩病毒 | 第18页 |
| 1.6 病毒纯化 | 第18-19页 |
| 1.6.1 Sepharose 4FF凝胶层析纯化 | 第18-19页 |
| 1.6.2 超速离心沉淀纯化 | 第19页 |
| 1.7 纯化病毒的检测 | 第19页 |
| 1.7.1 SDS-PAGE及Western-blot检测 | 第19页 |
| 1.7.2 测定蛋白及病毒含量 | 第19页 |
| 1.7.3 病毒的免疫原性 | 第19页 |
| 2 结果与分析 | 第19-23页 |
| 2.1 Sepharose 4FF凝胶层析纯化PRRSV图谱及SDS-PAGE和Western-blot分析 | 第19-20页 |
| 2.2 两种方法纯化效果的比较 | 第20-22页 |
| 2.3 纯化病毒免疫原性分析 | 第22-23页 |
| 3 讨论 | 第23-25页 |
| 第三章 PRRSV-IPMA筛选变异株HN07-1 单克隆抗体 | 第25-35页 |
| 1 材料与方法 | 第25-30页 |
| 1.1 病毒株、细胞及小鼠 | 第25页 |
| 1.2 主要试剂 | 第25页 |
| 1.3 试剂的配制 | 第25-26页 |
| 1.3.1 包被液（0.05M CBS；pH 9.6）的配制 | 第25页 |
| 1.3.2 PBST的配制 | 第25-26页 |
| 1.3.3 5%脱脂奶的配制 | 第26页 |
| 1.3.4 GNK溶液的配制 | 第26页 |
| 1.3.5 RPMI-1640 培养基的配制 | 第26页 |
| 1.3.6 DMEM培养基的配制 | 第26页 |
| 1.3.7 HAT选择性培养基及HT培养基的配制 | 第26页 |
| 1.3.8 细胞冻存液的配制 | 第26页 |
| 1.4 PRRSV病毒半数感染剂量（50% tissue culture infective dose；TCID50）测定 | 第26页 |
| 1.5 小鼠免疫 | 第26-27页 |
| 1.6 细胞计数方法 | 第27页 |
| 1.7 免疫过氧化物酶单层细胞试验（IPMA） | 第27-28页 |
| 1.8 杂交瘤细胞制备 | 第28-30页 |
| 1.8.1 SP2/0 细胞复苏与培养 | 第28页 |
| 1.8.2 小鼠脾细胞的制备 | 第28页 |
| 1.8.3 细胞融合 | 第28-29页 |
| 1.8.4 IPMA筛选阳性克隆孔 | 第29页 |
| 1.8.5 饲养细胞的制备及亚克隆 | 第29-30页 |
| 1.8.6 抗PRRSV单克隆抗体的大量制备 | 第30页 |
| 1.8.7 阳性杂交瘤细胞的冻存 | 第30页 |
| 1.9 单克隆抗体鉴定 | 第30页 |
| 1.9.1 单克隆抗体效价测定 | 第30页 |
| 1.9.2 单克隆抗体亚型鉴定 | 第30页 |
| 1.9.3 间接免疫荧光试验（IFA）验证抗PRRSV阳性克隆孔 | 第30页 |
| 2 结果与分析 | 第30-34页 |
| 2.1 PRRSV HN07-1 毒株感染Marc145细胞 | 第30-31页 |
| 2.2 小鼠血清抗体效价测定 | 第31-32页 |
| 2.3 单克隆抗体筛选与特性鉴定 | 第32-34页 |
| 2.3.1 IPMA筛选阳性克隆结果 | 第32-33页 |
| 2.3.2 单克隆抗体的阻断IPMA | 第33页 |
| 2.3.3 单克隆抗体效价测定 | 第33页 |
| 2.3.4 单克隆抗体亚型鉴定 | 第33页 |
| 2.3.5 IFA验证抗PRRSV单抗 | 第33-34页 |
| 3 讨论 | 第34-35页 |
| 第四章 美洲型PRRSV变异株HN07-1 N蛋白单克隆抗体鉴定 | 第35-49页 |
| 1 材料与方法 | 第35-43页 |
| 1.1 菌种、质粒 | 第35页 |
| 1.2 酶及主要试剂 | 第35页 |
| 1.3 主要试剂的配制 | 第35-36页 |
| 1.3.1 常用试剂 | 第35页 |
| 1.3.2 DEPC水的配制 | 第35-36页 |
| 1.3.3 培养基的配制 | 第36页 |
| 1.3.4 氨苄青霉素和潮霉素储存液的配制 | 第36页 |
| 1.3.5 溴化乙锭(EB)储存液（10 mg/mL） | 第36页 |
| 1.3.6 5×TAE电泳缓冲液（p H 8.0） | 第36页 |
| 1.3.7 1.5%琼脂糖凝胶的配制 | 第36页 |
| 1.3.8 包被液（0.05M CBS; p H 9.6）的配制 | 第36页 |
| 1.3.9 PBST的配制 | 第36页 |
| 1.4 PRRSV基因组RNA提取和cDNA的合成 | 第36-37页 |
| 1.4.1 PRRSV基因组RNA提取 | 第36-37页 |
| 1.4.2 cDNA的合成 | 第37页 |
| 1.5 PRRSV N蛋白基因的扩增 | 第37-39页 |
| 1.5.1 引物设计与合成 | 第37-38页 |
| 1.5.2 PCR扩增基因 | 第38页 |
| 1.5.3 PCR产物纯化 | 第38-39页 |
| 1.6 重组载体pMD-19T-N的构建 | 第39页 |
| 1.6.1 克隆质粒pMD-19T与PCR产物连接 | 第39页 |
| 1.6.2 重组质粒pMD-19T-N的筛选与鉴定 | 第39页 |
| 1.7 N蛋白表达基因的扩增 | 第39-40页 |
| 1.7.1 重组质粒pMD-19T-N的提取 | 第39-40页 |
| 1.7.2 N蛋白表达基因的扩增 | 第40页 |
| 1.8 构建重组质粒pET28a-N | 第40-41页 |
| 1.8.1 PCR产物和质粒pET28a双酶切 | 第40-41页 |
| 1.8.2 构建重组质粒pET28a-N | 第41页 |
| 1.8.3 重组质粒pET28a-N的筛选与鉴定 | 第41页 |
| 1.9 重组N蛋白的表达及抗N蛋白的单抗鉴定 | 第41-43页 |
| 1.9.1 重组N蛋白的表达 | 第41页 |
| 1.9.2 抗N蛋白的单抗鉴定 | 第41-42页 |
| 1.9.3 SDS-PAGE及Western blot | 第42-43页 |
| 1.9.4 抗N蛋白的单抗Western blot鉴定 | 第43页 |
| 2 结果与分析 | 第43-48页 |
| 2.1 PRRSV N蛋白克隆基因的扩增 | 第43页 |
| 2.2 菌落PCR鉴定重组质粒p MD-19T-N | 第43-44页 |
| 2.3 PRRSV N蛋白表达基因的扩增 | 第44页 |
| 2.4 菌落PCR和酶切鉴定重组质粒pET28a-N | 第44-45页 |
| 2.5 重组N蛋白表达结果 | 第45-47页 |
| 2.6 间接ELISA鉴定抗N蛋白单抗 | 第47页 |
| 2.7 Western-blot鉴定抗N蛋白单抗结果 | 第47-48页 |
| 3 讨论 | 第48-49页 |
| 全文总结 | 第49-50页 |
| 参考文献 | 第50-56页 |
| ABSTRACT | 第56-57页 |
