| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 第1章 前言 | 第13-22页 |
| 1 真菌细胞壁 | 第13-16页 |
| 1.1 真菌细胞壁的组成成分 | 第13-14页 |
| 1.2 真菌细胞壁的结构 | 第14-15页 |
| 1.3 真菌细胞壁的重构作用 | 第15-16页 |
| 2 真菌中的β-葡聚糖酶 | 第16-18页 |
| 2.1 真菌中β-1,3-葡聚糖酶的分类 | 第16-17页 |
| 2.2 真菌中β-1,3-葡聚糖酶的作用 | 第17页 |
| 2.3 真菌中β-1,3-葡聚糖酶的研究进展 | 第17-18页 |
| 3 重组表达系统 | 第18-20页 |
| 3.1 原核表达系统 | 第18-19页 |
| 3.2 真核表达系统 | 第19-20页 |
| 4 本论文的研究内容及意义 | 第20-22页 |
| 第2章 灰盖鬼伞外切β-1,3-葡聚糖酶的异源重组表达及性质研究 | 第22-49页 |
| 第一节 EXG1基因原核重组表达载体的构建 | 第22-31页 |
| 1 材料与方法 | 第22-30页 |
| 1.1 菌株和质粒 | 第22页 |
| 1.2 试剂和仪器 | 第22-23页 |
| 1.3 培养基及配制方法 | 第23-24页 |
| 1.4 灰盖鬼伞子实体培养 | 第24页 |
| 1.5 灰盖鬼伞总RNA提取及cDNA的合成 | 第24-25页 |
| 1.6 引物的设计与合成 | 第25-26页 |
| 1.7 EXG1基因的PCR扩增 | 第26-27页 |
| 1.8 PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳及胶回收 | 第27页 |
| 1.9 质粒pET28A(+)的提取及双酶切 | 第27页 |
| 1.10 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备 | 第27-28页 |
| 1.11 重组质粒的构建及感受态细胞的转化 | 第28-29页 |
| 1.12 阳性克隆的筛选及测序 | 第29-30页 |
| 2 结果 | 第30-31页 |
| 2.1 EXG1基因的PCR扩增产物鉴定 | 第30页 |
| 2.2 质粒pET28A(+)双酶切后的验证 | 第30-31页 |
| 2.3 菌落PCR结果鉴定 | 第31页 |
| 第二节 灰盖鬼伞外切葡聚糖酶在大肠杆菌中的异源表达及纯化 | 第31-40页 |
| 1 材料与方法 | 第31-38页 |
| 1.1 菌株与质粒 | 第31-32页 |
| 1.2 试剂和仪器 | 第32页 |
| 1.3 培养基及配制方法 | 第32-33页 |
| 1.4 重组质粒pET28A(+)-EXG1的提取 | 第33页 |
| 1.5 E.coli Rosetta感受态细胞的制备 | 第33-34页 |
| 1.6 表达菌pET28A(+)-EXG1-E.coli Rosetta的构建 | 第34页 |
| 1.7 EXG1基因的诱导表达 | 第34页 |
| 1.8 粗酶液的制备 | 第34页 |
| 1.9 粗酶液活性的测定方法 | 第34-35页 |
| 1.10 重组蛋白EXG1的分离纯化 | 第35-36页 |
| 1.11 透析除去蛋白洗脱液中的咪唑 | 第36-37页 |
| 1.12 透析后酶液中蛋白含量的测定 | 第37-38页 |
| 1.13 EXG1蛋白的聚丙烯酰氨凝胶电泳 | 第38页 |
| 2 结果 | 第38-40页 |
| 2.1 EXG1基因最佳诱导表达条件的确定 | 第38页 |
| 2.2 重组酶的分离和纯化 | 第38-39页 |
| 2.3 重组表达EXG1蛋白的鉴定 | 第39-40页 |
| 第三节 灰盖鬼伞外切葡聚糖酶EXG1的酶学性质研究 | 第40-47页 |
| 1 材料与方法 | 第40-43页 |
| 1.1 纯化的酶液 | 第40页 |
| 1.2 试剂及仪器 | 第40-41页 |
| 1.3 酶活测定方法 | 第41-42页 |
| 1.4 EXG1最适反应pH和pH稳定性的测定 | 第42页 |
| 1.5 EXG1最适反应温度和温度稳定性的测定 | 第42页 |
| 1.6 底物特异性测定 | 第42-43页 |
| 1.7 反应动力学常数计算 | 第43页 |
| 1.8 薄层层析分析EXG1的水解作用方式 | 第43页 |
| 2 结果 | 第43-47页 |
| 2.1 最适反应pH和pH稳定性 | 第43-44页 |
| 2.2 最适反应温度和温度稳定性 | 第44-45页 |
| 2.3 底物特异性 | 第45-46页 |
| 2.4 反应动力学常数 | 第46页 |
| 2.5 EXG1的作用方式及水解产物分析 | 第46-47页 |
| 第四节 讨论 | 第47-49页 |
| 第3章 灰盖鬼伞内切β-1,3(4)葡聚糖酶的异源重组表达和酶学性质研究 | 第49-92页 |
| 第一节 灰盖鬼伞内切β-1,3(4)葡聚糖酶的原核重组表达 | 第49-58页 |
| 1 eng16A原核重组表达质粒的构建 | 第49-54页 |
| 1.1 材料和方法 | 第50-52页 |
| 1.1.1 菌株和质粒 | 第50页 |
| 1.1.2 仪器和试剂 | 第50页 |
| 1.1.3 培养基和配制方法 | 第50页 |
| 1.1.4 灰盖鬼伞子实体培养 | 第50页 |
| 1.1.5 灰盖鬼伞总RNA提取及cDNA的合成 | 第50页 |
| 1.1.6 引物的设计与合成 | 第50-51页 |
| 1.1.7 eng16A基因的PCR扩增 | 第51-52页 |
| 1.1.8 PCR扩增产物电泳检测及胶回收 | 第52页 |
| 1.1.9 质粒pET28A(+)的提取及双酶切 | 第52页 |
| 1.1.10 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备 | 第52页 |
| 1.1.11 重组质粒的构建及感受态细胞的转化 | 第52页 |
| 1.1.12 阳性克隆的筛选 | 第52页 |
| 1.2 结果 | 第52-54页 |
| 1.2.1 eng16A基因的PCR扩增 | 第52-53页 |
| 1.2.2 重组表达质粒的构建 | 第53页 |
| 1.2.3 转化子的菌落PCR验证 | 第53-54页 |
| 2 eng16A基因在大肠杆菌中的异源表达 | 第54-57页 |
| 2.1 材料与方法 | 第54-55页 |
| 2.1.1 菌株与质粒 | 第54页 |
| 2.1.2 试剂与仪器 | 第54页 |
| 2.1.3 培养基及配制方法 | 第54-55页 |
| 2.1.4 重组质粒pET28A(+)-eng16A的提取 | 第55页 |
| 2.1.5 大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞的制备 | 第55页 |
| 2.1.6 表达菌pET28A(+)-eng16A-E.coli Rosetta的构建 | 第55页 |
| 2.1.7 重组菌的培养及eng16A基因的诱导表达 | 第55页 |
| 2.1.8 粗酶液的制备 | 第55页 |
| 2.1.9 粗酶液活性的测定 | 第55页 |
| 2.1.10 粗酶液的聚丙烯酰氨凝胶电泳 | 第55页 |
| 2.2 结果 | 第55-57页 |
| 2.2.1 重组菌的培养及eng16A基因的诱导表达 | 第55-56页 |
| 2.2.2 eng16A基因的蛋白产物鉴定 | 第56-57页 |
| 3 讨论 | 第57-58页 |
| 第二节 灰盖鬼伞内切β-1,3(4)葡聚糖酶基因的真核重组表达 | 第58-79页 |
| 1 eng16A基因真核重组表达载体的构建 | 第58-64页 |
| 1.1 材料与方法 | 第58-62页 |
| 1.1.1 菌株和质粒 | 第58页 |
| 1.1.2 试剂和仪器 | 第58-59页 |
| 1.1.3 培养基及配制方法 | 第59页 |
| 1.1.4 灰盖鬼伞子实体培养 | 第59页 |
| 1.1.5 灰盖鬼伞总RNA提取及cDNA的合成 | 第59页 |
| 1.1.6 引物的设计与合成 | 第59-60页 |
| 1.1.7 eng16A基因的PCR扩增 | 第60页 |
| 1.1.8 PCR扩增产物电泳检测及胶回收 | 第60页 |
| 1.1.9 质粒pPICZαA的提取及双酶切 | 第60-61页 |
| 1.1.10 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备 | 第61页 |
| 1.1.11 重组质粒的构建及感受态细胞的转化 | 第61页 |
| 1.1.12 阳性克隆的验证与测序 | 第61-62页 |
| 1.2 结果 | 第62-64页 |
| 1.2.1 eng16A基因PCR扩增产物鉴定 | 第62-63页 |
| 1.2.2 质粒载体pPICZαA的双酶切验证 | 第63-64页 |
| 1.2.3 重组表达质粒的构建 | 第64页 |
| 1.2.4 转化子菌落PCR结果鉴定 | 第64页 |
| 2 灰盖鬼伞内切β-1,3(4)-葡聚糖酶基因在毕赤酵母中的异源表达 | 第64-73页 |
| 2.1 材料与方法 | 第65-70页 |
| 2.1.1 菌株与质粒 | 第65页 |
| 2.1.2 试剂及仪器 | 第65-66页 |
| 2.1.3 培养基及配制方法 | 第66页 |
| 2.1.4 重组质粒pPICZαA-eng16A的提取 | 第66-67页 |
| 2.1.5 质粒pPICZαA-eng16A的线性化 | 第67-68页 |
| 2.1.6 表达菌株pPICZαA-eng16A-GS115的构建 | 第68页 |
| 2.1.7 阳性转化子的验证 | 第68-69页 |
| 2.1.8 菌落PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳 | 第69页 |
| 2.1.9 eng16A基因的诱导表达 | 第69-70页 |
| 2.1.10 发酵液的酶活测定 | 第70页 |
| 2.2 结果 | 第70-73页 |
| 2.2.1 质粒pPICZαA-eng16A的线性化验证 | 第70-71页 |
| 2.2.2 重组表达菌株的构建 | 第71页 |
| 2.2.3 转化子的菌落PCR验证 | 第71-72页 |
| 2.2.4 重组菌的发酵培养和eng16A基因的诱导表达 | 第72-73页 |
| 3 灰盖鬼伞内切β-1,3(4)-葡聚糖酶的分离纯化 | 第73-79页 |
| 3.1 材料与方法 | 第73-76页 |
| 3.1.1 试剂与仪器 | 第73-74页 |
| 3.1.2 粗酶液的获取 | 第74页 |
| 3.1.3 Ni-亲和层析纯化目的蛋白 | 第74-75页 |
| 3.1.4 测定目的蛋白洗脱液的酶活 | 第75页 |
| 3.1.5 洗脱液的透析及蛋白含量的测定 | 第75-76页 |
| 3.1.6 蛋白产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第76页 |
| 3.2 结果 | 第76-79页 |
| 3.2.1 重组酶的分离、纯化 | 第76-78页 |
| 3.2.2 纯化后重组酶的鉴定 | 第78-79页 |
| 第三节 灰盖鬼伞内切β-1,3(4)-葡聚糖酶的酶学性质研究 | 第79-92页 |
| 1 材料与方法 | 第79-83页 |
| 1.1 试剂与仪器 | 第79-80页 |
| 1.2 酶活测定方法 | 第80-81页 |
| 1.3 eng16A最适反应温度和温度稳定性的测定 | 第81页 |
| 1.4 eng16A最适反应pH和pH稳定性的测定 | 第81页 |
| 1.5 底物特异性测定 | 第81-82页 |
| 1.6 金属离子和化学试剂对酶活力影响的测定 | 第82页 |
| 1.7 酶反应动力学分析 | 第82页 |
| 1.8 eng16A水解产物的薄层层析色谱 | 第82-83页 |
| 1.9 eng16A基因在不同阶段表达量的测定 | 第83页 |
| 2 结果 | 第83-90页 |
| 2.1 eng16A的最适反应温度和温度稳定性 | 第83-84页 |
| 2.2 eng16A的最适反应pH和pH稳定性 | 第84-85页 |
| 2.3 eng16A的底物特异性 | 第85-86页 |
| 2.4 金属离子和化学试剂对eng16A活性的影响 | 第86-87页 |
| 2.5 eng16A的反应动力学常数 | 第87-88页 |
| 2.6 eng16A的作用方式和水解产物分析 | 第88-89页 |
| 2.7 eng16A不同生理阶段表达量分析 | 第89-90页 |
| 3 讨论 | 第90-92页 |
| 第4章 全文总结 | 第92-94页 |
| 参考文献 | 第94-101页 |
| 在读期间发表的学术论文及研究成果 | 第101-102页 |
| 致谢 | 第102页 |
