| 摘要 | 第1-13页 |
| Abstract | 第13-15页 |
| 第一章 引言 | 第15-40页 |
| ·miRNA介绍 | 第15-20页 |
| ·miRNA简介 | 第15页 |
| ·miRNA加工 | 第15-17页 |
| ·miRNA与靶标基因的碱基配对规律 | 第17-18页 |
| ·miRNA抑制靶标基因的作用机制 | 第18-20页 |
| ·miRNA靶基因鉴定研究方法介绍 | 第20-35页 |
| ·生物信息学的方法 | 第20-22页 |
| ·实验手段鉴定miRNA的靶基因 | 第22-35页 |
| I.2.2.1 Ago蛋白免疫共沉淀结合基因芯片的方法 | 第22-25页 |
| ·Ago蛋白CLIP(紫外交联免疫共沉淀)的方法 | 第25-31页 |
| ·其他方法鉴定miRNA的靶基因 | 第31-35页 |
| ·miR-17和miR-20a简介 | 第35-38页 |
| ·DAPK3(凋亡相关蛋白激酶3)简介 | 第38-40页 |
| 第二章 材料与方法 | 第40-68页 |
| ·材料 | 第40-47页 |
| ·菌株、细胞系及质粒 | 第40页 |
| ·生化试剂、溶液及其来源 | 第40-41页 |
| ·细胞培养、转染所用试剂与耗材 | 第41页 |
| ·酶类 | 第41-42页 |
| ·主要抗体 | 第42页 |
| ·RNA订购 | 第42页 |
| ·部分常用引物序列 | 第42-43页 |
| ·数据分析软件 | 第43页 |
| ·图像处理及绘图软件 | 第43页 |
| ·实验用到的主要仪器 | 第43-44页 |
| ·实验常用溶液的配制 | 第44-46页 |
| ·配制SDS-PAGE所使用的10%(W/V,g/ml)过硫酸铵(APS)：(10 ml) | 第44页 |
| ·2XSDS-PAGE上样缓冲液的配制(100 ml) | 第44页 |
| ·12% SDS-PAGE胶的配制 | 第44-45页 |
| ·10×Tris-Glycine电泳缓冲液的配制：(1L) | 第45页 |
| ·蛋白转膜缓冲液的配制 | 第45页 |
| ·TBST(1 L)的配制 | 第45-46页 |
| ·10×PBS缓冲液的配制(1 L) | 第46页 |
| ·DMEM细胞培养基的配制 | 第46页 |
| ·miRACE实验所用溶液的配制：(所用器皿需去RNA酶处理) | 第46-47页 |
| ·洗脱缓冲液(Wash buffer)(500 m1) | 第46-47页 |
| ·磷酸钠缓冲液(Na-Phosphate,pH=8.0,0.1 M) | 第47页 |
| ·1×多核苷酸激酶缓冲液(1×PNK buffer)(500 ml) | 第47页 |
| ·1×PNK+EGTA缓冲液(500 ml) | 第47页 |
| ·1×PK buffer(1×蛋白酶K缓冲液) | 第47页 |
| ·方法 | 第47-68页 |
| ·miRACE实验流程 | 第47-56页 |
| ·细胞培养与紫外交联处理 | 第48-49页 |
| ·免疫共沉淀(Immunoprecipitation,IP) | 第49-51页 |
| ·磁珠与抗体的偶联 | 第49-50页 |
| ·紫外交联处理后的细胞裂解液的制备 | 第50-51页 |
| ·免疫共沉淀 | 第51页 |
| ·逆转录(在磁珠上) | 第51-52页 |
| ·末端转移酶处理(在磁珠上) | 第52页 |
| ·蛋白酶K处理 | 第52-53页 |
| ·酒精沉淀及纯化 | 第53页 |
| ·槽式PCR扩增 | 第53-54页 |
| ·TA克隆和测序 | 第54-56页 |
| ·细胞培养 | 第56-57页 |
| ·细胞传代(T25培养瓶) | 第56页 |
| ·细胞冻存 | 第56页 |
| ·细胞复苏 | 第56-57页 |
| ·细胞转染方法 | 第57-59页 |
| ·miRNA和siRNA转染(24孔板的一个孔为例) | 第57-58页 |
| ·质粒转染方法 | 第58-59页 |
| ·RT-PCR | 第59-60页 |
| ·RNA提取 | 第59页 |
| ·反转录 | 第59-60页 |
| ·DNA酶Ⅰ(DNase Ⅰ)处理 | 第60页 |
| ·RT(以一个反应体系为例) | 第60页 |
| ·聚合酶链式反应(PCR) | 第60页 |
| ·免疫印迹(Western/Immunoblot) | 第60-63页 |
| ·SDS-PAGE以及转膜 | 第61页 |
| ·封闭以及抗体杂交 | 第61-62页 |
| ·显影 | 第62-63页 |
| ·免疫荧光(immunoflurorensence) | 第63-64页 |
| ·细胞固定及封闭 | 第63页 |
| ·抗体杂交及荧光显微镜观察 | 第63-64页 |
| ·慢病毒系统制备稳定细胞系 | 第64-66页 |
| ·慢病毒颗粒的制备 | 第64-65页 |
| ·靶细胞的病毒感染与筛选 | 第65-66页 |
| ·Bal B/C小鼠注射H22细胞成瘤实验 | 第66页 |
| ·双色荧光报告系统 | 第66-68页 |
| 第三章 结果与讨论 | 第68-93页 |
| ·miRACE方法的确定 | 第68-71页 |
| ·Ago2免疫共沉淀效率检测 | 第68-69页 |
| ·miRACE的结果及其分析 | 第69-71页 |
| ·验证miR-17和miR-20a的新靶标基因DAPK3 | 第71-79页 |
| ·miR-17和miR-20a的miRNP与DAPK3 mRNA结合 | 第71-72页 |
| ·miR-17和miR-20a与DAPK3在c-myc诱导的小鼠肿瘤中差异表达 | 第72-73页 |
| ·miR-17和miR-20a抑制DAPK3的翻译 | 第73-75页 |
| ·miR-17和miR-20a识别DAPK3编码区的靶标位点 | 第75-77页 |
| ·miR-17和miR-20a通过结合DAPK3第二个外显子上的靶标位点抑制DAPK3的表达 | 第77-79页 |
| ·DAPK3介导miR-17和miR-20a的原癌基因的功能 | 第79-85页 |
| ·DAPK3介导miR-17和miR-20a高表达的促进肿瘤生长 | 第79-81页 |
| ·DAPK3介导miR-17和miR-20a阻断导致的DNA双链断裂 | 第81-85页 |
| ·DAPK3磷酸化激活p53抑制miR 17-92簇的表达 | 第85-93页 |
| 参考文献 | 第93-100页 |
| 研究生期间发表或待发表论文 | 第100-101页 |
| 致谢 | 第101页 |
