| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-10页 |
| 第一章 绪论 | 第10-22页 |
| ·腈水合酶概述 | 第10-13页 |
| ·腈水合酶简介 | 第10-11页 |
| ·腈水合酶的热稳定性和区域选择性 | 第11-12页 |
| ·腈水合酶的结构与分类 | 第12-13页 |
| ·腈水合酶的结构与功能 | 第13-17页 |
| ·腈水合酶的晶体结构 | 第13-14页 |
| ·腈水合酶的催化机理 | 第14-15页 |
| ·腈水合酶金属离子摄取机理研究进展 | 第15-17页 |
| ·腈水合酶的工业应用 | 第17-18页 |
| ·酶的热稳定性改造 | 第18-20页 |
| ·非理性设计酶稳定性改造 | 第18页 |
| ·理性设计酶稳定性改造 | 第18-19页 |
| ·生物信息学软件在酶学中的应用 | 第19-20页 |
| ·本课题的研究背景、意义和主要研究内容 | 第20-22页 |
| 第二章 腈水合酶调控蛋白 P14K 在大肠杆菌中的表达 | 第22-38页 |
| ·引言 | 第22页 |
| ·材料与方法 | 第22-32页 |
| ·实验菌株与载体 | 第22页 |
| ·主要试剂 | 第22-23页 |
| ·培养基 | 第23页 |
| ·实验相关溶液配制 | 第23页 |
| ·实验仪器 | 第23页 |
| ·DNA 操作 | 第23-26页 |
| ·全质粒 PCR 方法定点突变 | 第26-27页 |
| ·表达载体构建 | 第27-29页 |
| ·腈水合酶和调控蛋白 P14K 的诱导表达 | 第29页 |
| ·腈水合酶和调控蛋白 P14K 的纯化 | 第29-31页 |
| ·分子模拟分析方法 | 第31页 |
| ·实验分析方法 | 第31-32页 |
| ·结果与讨论 | 第32-37页 |
| ·恶臭假单胞菌中腈水合酶全基因 ABP 的克隆 | 第32-33页 |
| ·利用 N 端原则在 E. coli 中成功表达调控蛋白 P14K | 第33-35页 |
| ·调控蛋白 P14K 大量稳定的表达 | 第35-36页 |
| ·分子内氢键的形成影响 P14K 蛋白质的稳定性 | 第36-37页 |
| ·本章小结 | 第37-38页 |
| 第三章 腈水合酶钴离子摄取机制的研究 | 第38-47页 |
| ·引言 | 第38-39页 |
| ·材料与方法 | 第39-40页 |
| ·实验菌株与载体 | 第39页 |
| ·主要试剂 | 第39页 |
| ·培养基 | 第39页 |
| ·实验相关溶液配制 | 第39页 |
| ·实验仪器 | 第39页 |
| ·DNA 操作 | 第39页 |
| ·表达载体的构建 | 第39-40页 |
| ·腈水合酶和调控蛋白 P14K 的诱导表达 | 第40页 |
| ·腈水合酶和调控蛋白 P14K 的纯化 | 第40页 |
| ·实验分析方法 | 第40页 |
| ·进化树的构建 | 第40页 |
| ·结果与讨论 | 第40-46页 |
| ·调控蛋白复合体α(strep-P14K)2分离与鉴定 | 第40-41页 |
| ·恶臭假单胞菌中腈水合酶遵循亚基自身交换机制 | 第41-43页 |
| ·α(P14K)2是亚基自身交换分子伴侣也是金属伴随子 | 第43-44页 |
| ·不同α亚基-β亚基顺序对腈水合酶酶活的影响 | 第44-45页 |
| ·基因型 ABP 与 BAP 型腈水合酶的分子进化 | 第45-46页 |
| ·本章小结 | 第46-47页 |
| 第四章 腈水合酶调控蛋白 P14K 上 C 端结构域结构与功能的研究 | 第47-57页 |
| ·引言 | 第47页 |
| ·材料与方法 | 第47-50页 |
| ·实验菌株与载体 | 第47页 |
| ·主要试剂 | 第47-48页 |
| ·培养基 | 第48页 |
| ·实验相关溶液配制 | 第48页 |
| ·实验仪器 | 第48页 |
| ·DNA 操作 | 第48页 |
| ·表达载体构建 | 第48-49页 |
| ·腈水合酶和调控蛋白 P14K 的诱导表达 | 第49页 |
| ·腈水合酶和调控蛋白 P14K 的纯化 | 第49页 |
| ·分子模拟分析方法 | 第49页 |
| ·实验分析方法 | 第49-50页 |
| ·结果与讨论 | 第50-55页 |
| ·P14K 分子动力学模拟 | 第50页 |
| ·P14K 上 C-domain 截断实验 | 第50-51页 |
| ·C-domain 高度柔性的作用 | 第51-53页 |
| ·C-domain 区域正电荷氨基酸的作用 | 第53-54页 |
| ·C-domain 的柔性和正电性可能与 Co 离子的摄取有关 | 第54-55页 |
| ·本章小结 | 第55-57页 |
| 第五章 自组装肽提高腈水合酶热稳定性的研究 | 第57-68页 |
| ·引言 | 第57-58页 |
| ·材料与方法 | 第58-62页 |
| ·实验菌株与载体 | 第58页 |
| ·主要试剂 | 第58页 |
| ·培养基 | 第58页 |
| ·实验相关溶液配制 | 第58页 |
| ·实验仪器 | 第58页 |
| ·DNA 操作 | 第58-59页 |
| ·CloneEZ 快速构建质粒 | 第59页 |
| ·表达载体构建 | 第59-61页 |
| ·腈水合酶的诱导表达 | 第61页 |
| ·腈水合酶的纯化 | 第61页 |
| ·实验分析方法 | 第61-62页 |
| ·分子模拟 Foldit 分析方法 | 第62页 |
| ·结果与讨论 | 第62-66页 |
| ·腈水合酶最适自组装肽融合的筛选 | 第62-63页 |
| ·融合 ELK16 能使腈水合酶形成活性包涵体 | 第63-65页 |
| ·ELK16 比其它 SAP 可能更具优势 | 第65-66页 |
| ·分别融合 EAK16/ELK16 对腈水合酶稳定性的影响 | 第66页 |
| ·本章小结 | 第66-68页 |
| 主要结论与展望 | 第68-70页 |
| 主要结论 | 第68-69页 |
| 展望 | 第69-70页 |
| 论文创新点 | 第70-71页 |
| 致谢 | 第71-72页 |
| 参考文献 | 第72-81页 |
| 附录 | 第81页 |
